Summary

Экспериментальные модели для изучения нейропротекции кислотного посткондиционирования против церебральной ишемии

Published: July 31, 2017
doi:

Summary

Кислотное посткондиционирование защищает от церебральной ишемии. Здесь мы представляем две модели для выполнения APC. Они достигаются, соответственно, путем переноса кортикотратальных срезов в кислый буфер после лишения кислород-глюкозы in vitro и при вдыхании 20% CO 2 после окклюзии средней церебральной артерии in vivo .

Abstract

Инсульт является одной из ведущих причин смертности и инвалидности во всем мире, с ограниченными терапевтическими подходами. В качестве эндогенной стратегии нейропротекции лечение после кондиционирования оказалось многообещающей терапией против церебральной ишемии. Однако сложные процедуры и потенциальные проблемы безопасности ограничивают их клиническое применение. Чтобы преодолеть эти недостатки, мы разработали кислотное посткондиционирование (APC) в качестве терапии экспериментальной фокальной церебральной ишемии. APC относится к легкой терапии ацидозом при вдыхании CO 2 во время реперфузии после ишемии. Здесь мы представляем две модели для выполнения APC in vitro и in vivo , соответственно. Для имитации церебральной ишемии применяли лечение личинки кислород-глюкозы (OGD) у мышей и окклюзию кортикостриала и окклюзию средней мозговой артерии (MCAO) у мышей. APC может быть просто достигнута путем переноса срезов мозга в кислый буфер, барботированный 20% CO 2 , oГ мышами, вдыхающими 20% CO 2 . APC показал значительные защитные эффекты против церебральной ишемии, что отразилось на жизнеспособности тканей и объеме инфаркта головного мозга.

Introduction

Инсульт является одной из ведущих причин смертности и инвалидности во всем мире. Большие усилия были предприняты для того, чтобы найти эффективные методы лечения инсульта в последние десятилетия, однако достижение довольно неудовлетворительное. Postconditioning – это процесс, которым манипулируют субтоксические стрессы после ишемического эпизода. Посткондиционирование, включая ишемическую, гипоксическую, низкую глюкозу и отдаленное ишемическое посткондиционирование, вызывает эндогенные адаптивные механизмы и, как доказано, является перспективной терапией против церебральной ишемии 1 , 2 , 3 , 4 . Однако ишемическое посткондиционирование может привести к дополнительным травмам. Конечное ишемическое посткондиционирование конечности обычно требует нескольких циклов окклюзии и реперфузии 5-20 минут на ипсилатеральных или двусторонних задних конечностях 5 , 6 , 7 . ThПоэтому эти посткондиционирующие манипуляции опасны или непрактичны в клинической практике. Чтобы преодолеть эти недостатки, мы разработали APC как терапию фокальной церебральной ишемии у мышей 8 . Индуцированный просто при вдыхании 20% CO 2 , APC значительно снижает ишемическое повреждение головного мозга более эффективным и безопасным способом. Недавно мы доказали, что APC расширяет окно реперфузии, подчеркивая важность APC для терапии инсульта 9 .

Здесь мы представляем две экспериментальные модели для изучения нейропротекции АРС против церебральной ишемии. Первая из них – модель лишения кислород-глюкозы (OGD) у мышей кортикостриала. Быстрая подготовка и передача срезов мозга в искусственную среду, обычно искусственную спинномозговую жидкость (ASCF), могут поддерживать жизнеспособность клеток и нейронную схему, что позволяет изучать функцию мозга in vitro 10 <Sup>, 11 . OGD в ASCF имитирует церебральную ишемию и индуцирует ишемическое повреждение 12 , 13 , 14 . После OGD срезы мозга обновляются в регулярном ASCF (r-ASCF), чтобы обеспечить реперфузию, а затем обработаны APC с использованием кислого ASCF, барботированного 20% CO 2 . Кортикостриальный срез сохраняет интактную гистологическую характеристику по сравнению с первичными культивируемыми клетками.

Для изучения функции мозга in vivo используется мышь средней мозговой артерии (MCAO). Средняя мозговая артерия блокируется вставкой мононити с пламенем через общую сонную артерию. В качестве одной из наиболее широко используемых моделей инсульта модель MCAO демонстрирует клиническую значимость, и применение мононити облегчает достижение реперфузии. Просто путем вдыхания нормального смешанного газа, содержащего 20% CO 2 после начала реперфузииN, APC продемонстрировал значительные защитные эффекты против церебральной ишемии, отмеченной уменьшенными объемами инфаркта головного мозга.

Protocol

Все эксперименты были одобрены и проведены в соответствии с этическими принципами Комитета по экспериментальному эксперименту для животных в Чжэцзянском университете и полностью соответствовали Руководству Национального института здравоохранения по уходу и использованию лаборат…

Representative Results

В описанной выше модели срединной кортикостриотической области выживаемость кортикостриотической части количественно определяли методом ТТК через 1 ч после реперфузии. Конверсия ТТК рассчитывалась путем нормализации поглощения на 490 нм до контрольного среза. Согл?…

Discussion

Здесь мы представляем две экспериментальные модели для изучения нейропротекции АРС против церебральной ишемии. В срезах головного мозга APC достигается путем инкубации мышей кортикостриальных срезов в кислом буфере, барботированном 20% CO 2 после начала реперфузии, тогда как в мод?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась Национальным фондом естественных наук Китая (81573406, 81373393, 81273506, 81221003, 81473186 и 81402907), Фондом естественных наук провинции Чжэцзян (LR15H310001) и Программой для ведущей команды инновационной команды S & T в Чжэцзяне (2011R50014).

Materials

Sodium chloride Sigma S5886
Potassium chloride Sigma P5405
Potassium phosphate monobasic Sigma P9791
Magnesium sulfate Sigma M2643
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Calcium chloride dihydrate Sigma C5080
D-(+)-Glucose Sigma G7021
Vibratome Leica VT1000 S
2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride Sigma T8877
Absolute Ethanol Aladdin Industrial Corporation E111993
Dimethyl sulfoxide Sigma D8418
Laser Doppler Flowmetry Moor Instruments Ltd Model Moor VMS-LDF2
Diethyl ether anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Corporation 80059618
Trichloroacetaldehycle hydrate Sinopharm Chemical Reagent Corporation 30037517
10% Formalin Aladdin Industrial Corporation F111936
24-well plates Jet Biofil TCP-010-024

Referenzen

  1. Zhao, H., Sapolsky, R. M., Steinberg, G. K. Interrupting reperfusion as a stroke therapy: ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (9), 1114-1121 (2006).
  2. Leconte, C., et al. Delayed hypoxic postconditioning protects against cerebral ischemia in the mouse. Stroke. 40 (10), 3349-3355 (2009).
  3. Fan, Y. Y., et al. Transient lack of glucose but not O2 is involved in ischemic postconditioning-induced neuroprotection. CNS Neurosci Ther. 19 (1), 30-37 (2013).
  4. Hess, D. C., Hoda, M. N., Bhatia, K. Remote limb perconditioning [corrected] and postconditioning: will it translate into a promising treatment for acute stroke. Stroke. 44 (4), 1191-1197 (2013).
  5. Ren, C., Yan, Z., Wei, D., Gao, X., Chen, X., Zhao, H. Limb remote ischemic postconditioning protects against focal ischemia in rats. Brain Res. 1288, 88-94 (2009).
  6. Sun, J., et al. Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K(ATP) channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (5), 851-859 (2012).
  7. Li, P., et al. Remote limb ischemic postconditioning protects mouse brain against cerebral ischemia/reperfusion injury via upregulating expression of Nrf2, HO-1 and NQO-1 in mice. Int J Neurosci. , 1-8 (2015).
  8. Fan, Y. Y., et al. A novel neuroprotective strategy for ischemic stroke: transient mild acidosis treatment by CO2 inhalation at reperfusion. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 275-283 (2014).
  9. Shen, Z., et al. PARK2-dependent mitophagy induced by acidic postconditioning protects against focal cerebral ischemia and extends the reperfusion window. Autophagy. , (2017).
  10. Skolnik, J., Takacs, L., Szende, E. In vitro oxygen consumption of slices from kidney, brain, cortex and liver in hypoxia. Nature. 209 (5020), 305 (1966).
  11. Lynch, G., Schubert, P. The use of in vitro. brain slices for multidisciplinary studies of synaptic function. Annu Rev Neurosci. 3, 1-22 (1980).
  12. Zheng, S., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces purkinje cell death in an in vitro model of rat cerebellar ischemia. Neurowissenschaften. 118 (1), 99-106 (2003).
  13. Yin, B., Barrionuevo, G., Weber, S. G. Optimized real-time monitoring of glutathione redox status in single pyramidal neurons in organotypic hippocampal slices during oxygen-glucose deprivation and reperfusion. ACS Chem Neurosci. 6 (11), 1838-1848 (2015).
  14. Medvedeva, Y. V., Ji, S., Yin, H. Z., Weiss, J. H. Differential vulnerability of CA1 vs CA3 pyramidal neurons after ischemia: possible relationship to sources of Zn2+ accumulation and its entry into and prolonged effects on mitochondria. J Neurosci. , (2016).
  15. Pignataro, G., et al. In vivo and in vitro characterization of a novel neuroprotective strategy for stroke: ischemic postconditioning. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (2), 232-241 (2008).
  16. Zhang, X., Ding, H. Z., Jiang, S., Zeng, Y. M., Tang, Q. F. An in vitro study of the neuroprotective effect of propofol on hypoxic hippocampal slice. Brain Inj. 28 (13-14), 1758-1765 (2014).
  17. Niu, Y., et al. Chemical profiling with HPLC-FTMS of exogenous and endogenous chemicals susceptible to the administration of chotosan in an animal model of type 2 diabetes-induced dementia. J Pharm Biomed Anal. 104, 21-30 (2015).

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Zheng, Y., Shen, Z., Wu, X., Jiang, L., Hu, W., Chen, Z., Zhang, X. Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia. J. Vis. Exp. (125), e55931, doi:10.3791/55931 (2017).

View Video