Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

Summary

We beschrijven de gedetailleerde procedures en de strategieën voor het meten van de mechanische eigenschappen en mechanische ontvouwen trajecten van één eiwitmolecules met behulp van een atomic force microscope. We tonen ook representatieve resultaten als een referentie voor selectie en motivering van goed één eiwit molecuul opnames.

Abstract

De bepaling van het vouwen proces van eiwitten uit hun aminozuur volgorde naar hun oorspronkelijke 3D-structuur is een belangrijk probleem in de biologie. Atomaire kracht microscopie (AFM) kan dit probleem aanpakken doordat rekken en ontspanning van één eiwitmolecules, waardoor direct bewijs van specifieke ontvouwen en uiteinde kenmerken. AFM gebaseerde single-molecuul kracht-spectroscopie (AFM-SBF) biedt een manier voor het consequent meten van hoog-energetische conformaties in eiwitten die in traditionele bulk (biochemische) metingen niet mogelijk zijn. Hoewel tal van papieren werden gepubliceerd om aan te tonen van de beginselen van AFM-de SBF, is het niet eenvoudig om uit te voeren van de SBF experimenten te wijten aan een gebrek aan een uitputtend volledige protocol. In deze studie, we kort illustreren de beginselen van AFM en uitgebreid de protocollen, procedures en data-analyse in detail te beschrijven als een richtsnoer te bereiken goede resultaten van de SBF experimenten. We blijk geven van representatieve SBF resultaten van één eiwit mechanische ontvouwen metingen en wij het oplossen van strategieën voor enkele voorkomende problemen.

Introduction

Voorschotten in één molecuul kracht spectroscopie (SBF) door AFM hebt mechanische manipulatie en precieze karakterisering van één eiwitmolecules ingeschakeld. Deze karakterisering heeft nieuwe inzichten over eiwit mechanica^1,2,³, eiwit-ligand interacties⁴, eiwit-eiwit interacties⁵, waar de eiwitvouwing geproduceerd en ontworpen op basis van eiwitten materialen^6,7,8. De SBF is vooral handig voor de studie van eiwit ontplooiing, zoals die zich uitstrekt door AFM kunnen de chemische en fysische bindingen in het molecuul eiwit geleidelijk uitbreiden volgens hun stijfheid, die aanleiding geven tot een steeds toenemende werklast lengte. Deze overstrekking van een eiwit-molecuul kan produceren een abrupte overgang in de bocht van de kracht-extensie wat resulteert in een breuk-gebeurtenis (of dwingen piek). De piek van kracht geeft directe informatie over de openende kracht en structurele verandering van de eiwitten tijdens het mechanische ontvouwen. Één van de eerste studies met behulp van AFM titin¹ gemeten en gevonden nieuwe aspecten van eiwit ontvouwen en uiteinde onder fysiologische omstandigheden zonder gebruik te maken van onnatuurlijke denatureringsmiddelen zoals geconcentreerde chemicaliën of extreme temperaturen.

De SBF experimenten worden uitgevoerd op een scala aan instrumenten, hoewel hier we alleen de AFM overwegen. De AFM bestaat uit vier hoofdelementen: de sonde, de detector, de monsterhouder en de piëzo-elektrische scanner. De sonde is een scherpe tip over het free-swinging einde van een cantilever. Na kalibratie, wordt buigend van de uitkraging tijdens het uitrekken van een bijgevoegde molecuul gemeten met behulp van een laserstraal die blijkt uit de achterkant van de uitkraging precies bepalen met behulp van de wet van Hooke de krachten. De teruggekaatste laser beam projecten in een Kwadrant fotodiode detector die een spanning in verhouding tot de verplaatsing van de laserstraal uit het midden van de diode produceert. Het substraat met de eiwitSteekproef in vloeistof is gemonteerd op een 3D piëzo-elektrische podium die kan worden bestuurd met sub nanometer precisie. Een computer leest de spanning van de detectoren fotodiode en regelt de 3D fase door middel van een computergestuurde voedingsspanning. Deze piëzo actuator fasen zijn meestal uitgerust met capacitieve of spanningsmeter positie sensoren juist maatregel piezo verplaatsing en juiste hysteresis via feedback controlesysteem. De signaaluitgang van de sensor van de piëzo-controller wordt omgezet in afstand met behulp van de constante spanning van de piezo thats fabriek-gekalibreerd. Een voorbeeld kracht-extensie curve van een trekken experiment is afgebeeld in Figuur 2.

Er zijn twee soorten AFM-SBF experimenten: constante snelheid en constante kracht trekken metingen. Constante kracht de SBF metingen worden beschreven in Oberhauser et al. ⁹, terwijl hier richten we ons op constante snelheid metingen. Een typische AFM constante snelheid trekken experiment wordt gedaan door middel van spanning tot een piezo voorzichtig verplaatsen een substraat ten opzichte van een ‘ Freischwinger ‘-tip. Een typisch experiment heeft de tip in eerste instantie tegen het oppervlak te drukken. De trekken meting is begonnen door het bewegen van het substraat vanaf de tip om uit contact. Als een eiwit in contact met de tip in eerste instantie komt, het zal worden getrokken en de zich ontvouwende spoor van geweld tegen verplaatsing zullen worden gemeten. Het substraat wordt dan teruggebracht in contact met het uiteinde en een ontspannende trace wordt gemeten waar de vouwing van eiwitten kan worden bepaald uit de verplaatsing van kracht.

Protocol

1. eiwitten voorbereiding Het klonen van DNA. Een opeenvolging van DNA van belang, bijvoorbeeld, de opeenvolging van DNA van NI10C10, synthetiseren of isoleren via PCR van het organisme van de host met behulp van standaard moleculaire biologie technieken11. Het gen van belang met beperkingsplaatsen flank tijdens synthese of door het plaatsen van sites in de 5′-eind van de PCR inleidingen overeen moeten komen met een module in de plasmid…

Representative Results

Representatieve resultaten van dit protocol zijn afgebeeld in Figuur 2. Beide panelen tonen representatieve kracht-extensie curven van eiwitten. De top ziet u resultaten van een I91-polyprotein, terwijl de onderkant de I91 proteïne flankerende een eiwit toont-of-interest, het NI10C molecuul. Deze opnames tonen de karakteristieke kracht van I91 (200 pN) en lengte increment contour (28 nm) waarin wordt aangegeven dat de uitlijning en de kalibratie v…

Discussion

Een cruciale stap in het protocol is het gebruik van een polyprotein, beschreven in stap 1.1.2, die als een positieve controle fungeert aan de “vingerafdruk” single-molecuul gebeurtenissen. In het algemeen, er moet worden ontvouwen evenementen van de polyprotein eiwitten (voor I91, betekent dit een ontvouwen troepenmacht van ongeveer 200 pN en contour toename met lengte van ongeveer 28 nm) tot ondubbelzinnige conclusie is gekomen dat de proteïne van belang uitgevouwen is. Bijvoorbeeld, wanneer de proteïne van belang wo…

Materials

AFM Specimen Discs, 15mm diameter	Ted Pella, Inc.	16218	Serve as base for glass substrate
Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick	Ted Pella, Inc.	26024	serve as glass substrate and base for gold coating
Adhesive Tabs	Ted Pella, Inc.	16079	Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips
STD Multimode head assembly	Bruker Nano Inc.	1B75C	AFM head
Glass probe holder	Bruker Nano Inc.	MTFML-V2	Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM.
Microlever AFM probes	Bruker Nano Inc.	MLCT	Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes
AFM probes with Au coated tips	Bruker Nano Inc.	OBL-10	Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force
Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs	National Instruments	PCI-6259	Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators
LISA Linear Piezo Stage Actuators	Physik Instrumente LP	P-753.11C	Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements
XY Piezo Stage	Physik Instrumente LP	P-541.2CD	Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface