Spettroscopia della forza delle singole molecole proteiche utilizzando un microscopio a forza atomica
Summary
Descriviamo le procedure dettagliate e le strategie per misurare le proprietà meccaniche e percorsi meccanici spiegamento di singole molecole proteiche utilizzando un microscopio a forza atomica. Mostriamo anche risultati rappresentativi come riferimento per la selezione e giustificazione delle registrazioni di buona singola proteina molecola.
Abstract
La determinazione del processo di folding delle proteine da loro sequenza dell’amminoacido alla loro struttura 3D nativo è un problema importante nella biologia. Microscopia a forza atomica (AFM) può risolvere questo problema, consentendo di stretching e rilassamento delle singole molecole proteiche, che dà prova diretta di specifici dispiegamento e ripiegamento caratteristiche. AFM-base singola molecola-spettroscopia della forza (AFM-SMF) fornisce un mezzo per misurare costantemente conformazioni ad alta energia in proteine che non sono possibili nelle misurazioni (biochimica) tradizionale alla rinfusa. Sebbene numerosi lavori sono stati pubblicati per mostrare i principi di AFM-SMF, non è facile per condurre esperimenti di SMF a causa della mancanza di un protocollo esaustivamente completo. In questo studio, abbiamo brevemente illustrare i principi di AFM e dettaglio estesamente i protocolli, procedure e analisi dei dati come linee guida per ottenere buoni risultati dagli esperimenti di SMF. Dimostriamo risultati rappresentativi di SMF di misure svolgimento meccaniche singole proteine e forniamo troubleshooting strategie per alcuni comunemente incontrato problemi.
Introduction
Gli avanzamenti nella spettroscopia di forza di singola molecola (SMF) mediante AFM hanno permesso la manipolazione meccanica e precisa caratterizzazione di singole molecole proteiche. Questa caratterizzazione ha prodotto nuove conoscenze su proteina meccanica1,2, proteina pieghevole3, di interazioni proteina-ligando4, di interazioni proteina-proteina5, e su base proteica ingegnerizzati materiali6,7,8. SMF sono particolarmente utile per lo studio di proteine sta svolgendo, come lo stretching di AFM permette i legami chimici e fisici all’interno della molecola di proteina di estendere gradualmente secondo la loro rigidità, che dà origine ad una lunghezza di contorno continuamente crescente. Questo overstretching di una molecola di proteina può produrre una transizione brusca della curva forza-estensione con conseguente in un evento di rottura (o forza di picco). Il picco di forza dà informazioni dirette sul cambiamento spiegamento di forza e strutturali della proteina durante il processo di distensione meccanico. Uno dei primi studi utilizzando AFM misurato titin1 e trovato nuovi aspetti della proteina dispiegamento e ripiegamento in condizioni fisiologiche, senza l’uso di denaturanti innaturali come prodotti chimici concentrati o temperature estreme.
Anche se qui consideriamo solo l’AFM, una varietà di strumenti, vengono condotti esperimenti di SMF. L’AFM è composto da quattro elementi principali: la sonda, il rivelatore, il portacampioni e lo scanner piezoelettrico. La sonda è una punta forte sull’estremità di oscillazione libera di un cantilever. Dopo la calibrazione, flessione del cantilever durante l’allungamento di una molecola associata viene misurata utilizzando un raggio laser che viene riflessa dalla parte posteriore del cantilever per determinare con precisione le forze usando la legge di Hooke. I progetti del fascio laser riflessa in un rivelatore di fotodiodo del quadrante che produce una tensione in proporzione lo spostamento del raggio laser dal centro del diodo. Il substrato con il campione della proteina nel liquido è montato su un palcoscenico piezoelettrico 3D che può essere controllato con precisione sub-nanometrica. Un computer legge la tensione dai rivelatori fotodiodo e controlla la fase 3D attraverso un rifornimento di tensione controllati dal computer. Queste fasi di azionatore piezo sono solitamente dotate di capacitivo o estensimetri sensori di posizione di precisamente lo spostamento di piezo-elettrico di misura e di isteresi corretta attraverso il sistema di controllo retroazionato. L’uscita di segnale del sensore dal controller di piezo è convertito in distanza utilizzando la costante tensione di piezo che è calibrato in fabbrica. Una curva di forza-estensione di esempio da un esperimento di trazione è illustrata nella Figura 2.
Ci sono due tipi di esperimenti di AFM-SMF: velocità costante e costante forza tirando misurazioni. Misurazioni di forza costante SMF sono descritti in Oberhauser et al. 9, mentre qui ci concentriamo sulle misurazioni di velocità costante. Un tipico esperimento di trazione omocinetico AFM avviene fornendo tensione a un piezo per spostare delicatamente un substrato rispetto una punta a sbalzo. Un tipico esperimento ha la punta inizialmente premendo contro la superficie. La misurazione di trazione è cominciata spostando il substrato distanza dalla punta per portare fuori contatto. Se una proteina entra in contatto con la punta inizialmente, esso sarà tirato e la traccia di spiegamento della forza contro lo spostamento sarà misurata. Il substrato allora è portato di nuovo in contatto con la punta e una traccia rilassante è misurata dove piegatura della proteina può essere determinato dallo spostamento di forza.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un passo fondamentale nel protocollo è l’utilizzo di una poliproteina, descritto al punto 1.1.2, che serve come controllo positivo a singola molecola eventi “impronte digitali”. In genere, ci deve svolgersi eventi delle proteine poliproteina (per I91, ciò significa una forza spiegamento di incremento di lunghezza circa 200 pN e contorno di circa 28 nm) a concludere in modo inequivocabile che la proteina di interesse è stata spiegata. Ad esempio, quando la proteina di interesse è affiancata da tre I91 domini da entram…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation sovvenzioni MCB-1244297 e MCB-1517245 a PEM.
Materials
| AFM Specimen Discs, 15mm diameter | Ted Pella, Inc. | 16218 | Serve as base for glass substrate |
| Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick | Ted Pella, Inc. | 26024 | serve as glass substrate and base for gold coating |
| Adhesive Tabs | Ted Pella, Inc. | 16079 | Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips |
| STD Multimode head assembly | Bruker Nano Inc. | 1B75C | AFM head |
| Glass probe holder | Bruker Nano Inc. | MTFML-V2 | Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM. |
| Microlever AFM probes | Bruker Nano Inc. | MLCT | Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes |
| AFM probes with Au coated tips | Bruker Nano Inc. | OBL-10 | Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force |
| Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs | National Instruments | PCI-6259 | Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators |
| LISA Linear Piezo Stage Actuators | Physik Instrumente LP | P-753.11C | Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements |
| XY Piezo Stage | Physik Instrumente LP | P-541.2CD | Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface |
Referenzen
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