原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法
Summary
詳細な手順と機械的性質および原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子のアンフォールディング経路を機械的に測定するための戦略について述べる。また選択と良い単一蛋白質分子の録音の正当化のための参照として代表的な結果を述べる.
Abstract
ネイティブ 3 D 構造にそのアミノ酸配列からのタンパク質の折り畳み過程の定量生物学の重要な問題では。原子間力顕微鏡 (AFM) ストレッチと特定のアンフォールディングとリフォールディング特性の直接証拠を与える単一タンパク質分子の弛緩を有効にしてこの問題に対処することができます。原子間力顕微鏡による単一分子力分光 (原子間力顕微鏡 SMF) は、高エネルギーは従来のばら積み (生化学) 測定不可能なタンパク質立体を一貫して測定するための手段を提供します。AFM SMF の原則を示すため、公開された多数の論文じゃない簡単に網羅的なプロトコルの不足のための SMF 実験を実施できます。本研究では、AFM の原理を簡単に説明して SMF の実験からのよい結果を達成するためにガイドラインとしてプロトコル、手順、およびデータ分析の詳細を広く。単一蛋白質機械的展開測定の代表的な SMF 結果を示すし、一般的、いくつかの戦略をトラブルシューティング問題が発生いたします。
Introduction
原子間力顕微鏡による単一分子力分光 (SMF) の進歩は、機械操作と単一タンパク質分子の正確な評価に有効にしています。この特性は、タンパク質力学1,2,3タンパク質-リガンド相互作用4、蛋白質蛋白質の相互作用5、フォールディングについて知見を生産している、タンパク質ベース設計材料6,7,8。SMF は特にタンパク質を調べる場合に役立ちます AFM によるストレッチとして展開、継続的に増加輪郭線長を生じ、その剛性によると徐々 に拡張するタンパク質分子内における化学的および物理的債をできます。このタンパク質分子の overstretching 破裂イベントの結果力拡張曲線の急激な遷移を生成 (したり強制的にピーク)。力ピーク値は、力学の展開プロセス中にタンパク質の展開力と構造変化に関する直接的な情報を提供します。AFM を用いた最初の研究の一つは、タイチン1を測定し、タンパク質のアンフォールディングとリフォールディング集中化学薬品、極端な温度のような不自然な変性剤を使用せず生理条件下での新しい側面を発見します。
ここで原子間力顕微鏡だけを考えても SMF 実験をさまざまな楽器に行った.AFM は、4 つの主要な要素で構成されます: プローブ、検出器、試料ホルダー、圧電スキャナー。プローブは、片持ちの揺れる端に鋭い先端です。キャリブレーション後フックの法則を使用して力を正確に判断するカンチレバーの背面から反射されるレーザー光を用いた測定接続されている分子のストレッチ中に、片持ち梁の曲げ。ダイオード センターからのレーザービームの変位に比例した電圧を作り出す象限フォト ダイオード検出器に反射レーザー ビーム プロジェクト。流体の蛋白質のサンプルの基板は、サブナノ精度で制御することができます 3 D 圧電ステージ上にマウントされます。フォト ダイオード検出器からの電圧を読み取り、コンピューター制御の電圧供給を通じて 3 D ステージを制御コンピューター。これらの圧電アクチュエータの段階通常容量が装備されているまたは歪みゲージ センサー位置正確に測定圧電変位してフィードバック制御システムを通じて正しい履歴。圧電コント ローラーからセンサー信号出力は、工場出荷時校正は、ピエゾの電圧定数を使用して距離に変換されます。引っ張る実験例力拡張曲線は図 2に示します。
AFM SMF 実験の 2 つのタイプがある: 一定速度、一定力測定を引っ張るします。Oberhauserらのコンスタントフォース SMF 測定値の説明します。9、ここで我々 は一定速度の測定に焦点を当てる一方。典型的な原子間力顕微鏡等速引張実験は、カンチレバー先端に対して基板をゆっくり移動するピエゾに電圧を提供することによって行われます。典型的な実験は最初表面に対して押すとヒントです。引きの測定は、接触の引き出すため先端から基板を移動によって開始されます。場合蛋白質の最初の接触は先端、それが取得され、変位に対する力の展開のトレースで測定されます。先端と接触し、基板を戻され、タンパク質の折り畳みを決定力変位からことができます、リラックスしたトレースを測定します。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルの重要なステップは、単一分子イベント「指紋」をポジティブ コントロールとして機能する 1.1.2、の手順に従って、エンベロープタンパク質の使用です。一般に、ある必要があります開くポリタンパク質蛋白質のイベント (I91、つまり約 28 約 200 pN と輪郭線長さ増分の展開力 nm) 興味の蛋白質が折り畳まれたされていることを明確に締結します。たとえば、興味の蛋白質は、どち?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、全米科学財団助成金 MCB 1244297 と PEM に MCB 1517245 によって支持されました。
Materials
| AFM Specimen Discs, 15mm diameter | Ted Pella, Inc. | 16218 | Serve as base for glass substrate |
| Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick | Ted Pella, Inc. | 26024 | serve as glass substrate and base for gold coating |
| Adhesive Tabs | Ted Pella, Inc. | 16079 | Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips |
| STD Multimode head assembly | Bruker Nano Inc. | 1B75C | AFM head |
| Glass probe holder | Bruker Nano Inc. | MTFML-V2 | Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM. |
| Microlever AFM probes | Bruker Nano Inc. | MLCT | Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes |
| AFM probes with Au coated tips | Bruker Nano Inc. | OBL-10 | Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force |
| Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs | National Instruments | PCI-6259 | Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators |
| LISA Linear Piezo Stage Actuators | Physik Instrumente LP | P-753.11C | Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements |
| XY Piezo Stage | Physik Instrumente LP | P-541.2CD | Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface |
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