Génération efficace et l’édition de CISP exempte d’engraissement de cellules pancréatiques humaines en utilisant le système CRISPR-Cas9
Summary
Ce protocole décrit en détail la génération des cellules souches pluripotentes induites exempte d’empreinte (CISP) de cellules pancréatiques humaines dans des conditions sans chargeur, suivie d’édition en utilisant CRISPR/Cas9 ribonucléoprotéines et la caractérisation de la mis à jour le clones de cellules individuelles.
Abstract
Les cellules souches pluripotentes embryonnaires et induits peuvent se renouveler et se différencier en plusieurs types de cellules du corps. Les cellules pluripotentes sont donc convoités pour la recherche en médecine régénératrice et sont actuellement en essais cliniques pour les maladies de l’oeil, diabète, maladies cardiaques et autres troubles. Le potentiel de se différencier en cellules spécialisées types couplés avec les progrès récents dans le génome de technologies, y compris le système CRISPR/Cas d’édition offrent des possibilités supplémentaires pour adapter le génome de l’iPSC pour applications variées y compris la maladie de modélisation, thérapie génique et polarisation des voies de différenciation, pour n’en nommer que quelques-uns. Parmi les technologies d’édition disponibles, le CRISPR/Cas9 de Streptococcus pyogenes a émergé comme un outil de choix pour l’édition spécifique du génome eucaryote. Les CRISPRs sont facilement accessible, peu coûteuse et très efficace en ingénierie des modifications ciblées. Le système nécessite une nucléase Cas9 et une séquence de guide (20-mer) spécifique à la cible génomique attenante à un 3-nucléotides « NGG » protospacer-adjacent-motif (PAM) pour le ciblage Cas9 au locus génomique désiré, aux côtés d’un traceur universel de liaison Cas9 (RNA ensemble appelé ARN de guide unique ou sgRNA). Nous présentons ici une étape par étape du protocole pour la production efficace d’iPSC alimentation indépendante et sans encombrement et décrire les méthodologies pour l’édition de génome d’iPSC en utilisant des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) de Cas9. Le génome du protocole d’édition est efficace et peut être facilement multiplexé par pre-complexants sgRNAs pour plus d’une cible avec la protéine Cas9 et débitent simultanément dans les cellules. Enfin, les auteurs décrivent une approche simplifiée pour l’identification et la caractérisation de la CISP, avec les modifications souhaitées. Pris ensemble, les stratégies décrites sont censés rationaliser la production et l’édition d’iPSC pour des applications multiples.
Introduction
La reprogrammation de cellules somatiques humaines à l’État pluripotent par la surexpression des facteurs de reprogrammation a révolutionné la recherche sur les cellules souches avec des applications dans la modélisation de la maladie, médecine régénérative et développement de médicaments. Plusieurs méthodes de reprogrammation non viraux sont disponibles pour l’administration de facteurs de reprogrammation et de générer la CISP, mais le processus est travail intensif et pas très efficace1. Les méthodes virales, bien qu’efficace, sont associés aux problèmes d’intégration de virus et de la tumorigénicité2,3,4. Dans ce manuscrit, les auteurs rapportent l’utilisation de virus cytoplasmique de Sendai pour livraison reprogrammation des facteurs et l’établissement de lignes iPSC exempte d’empreinte qui n’ont pas l’intégration de toute séquence de vecteur viral dans leurs génomes5. Le virus de Sendai est un virus à ARN qui est dilué de passages de cytoplasme ~ 10 cellule après l’infection et produit des facteurs de reprogrammation en abondance, conduisant à la rapide et efficace de reprogrammation6,7. Le CISP établie peut ensuite être facilement passés à un milieu sans alimentation afin d’éviter l’utilisation de fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) comme alimentation cellules8.
Dans cette publication, outre décrivant le virus Sendai médiée par la reprogrammation, nous décrivons également un protocole amélioré pour l’édition CISP, qui a le potentiel d’approvisionnement illimité de cellules humaines avec des modifications génétiques souhaitées pour la recherche. Nous avons utilisé la technologie CRISPR/Cas9 pour la modification de la CISP, qui est maintenant utilisé pour un large éventail d’applications dont knock-ins et masquages, destructions à grande échelle de génomiques, bibliothèque mise en commun de dépistage pour la découverte du gène, génie génétique de nombreux organismes modèles et la thérapie de gène pour9,10,11. Cette technique implique la formation de complexes de Streptococcus pyogenes-dérivées Cas9 nucléase et 20-mer guident ARN qui obtenir une reconnaissance de la cible par appariement de bases avec la séquence cible génomique adjacent à 3′ les protospacer de nucléotides adjacent séquence de motif (PAM). La nucléase Cas9 induit une nucléotides double brin pause ~ 3 sur le site de PAM, qui est par la suite réparé principalement par la fin non homologue, rejoindre la voie (NHEJ) conduisant à des insertions ou suppressions dans le cadre de lecture ouvert et donc fonctionnel masquage des gènes12.
Notre protocole amélioré inclut les détails pour la culture de cellules pancréatiques humaines, leur reprogrammation sur mitotically inactivés fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) pour atteindre une plus grande efficacité de reprogrammation, adaptation ultérieure de culture sans chargeur le Matrigel, caractérisation de CISP établie, CRISPR guidée RNA conception, préparation, livraison en CISP complexes RNP, seule cellule tri pour générer des lignées clonales de CISP édité, facile de dépistage et identification des modifications et la caractérisation des clones de cellule unique. Destructions génomiques ont été efficacement générées dans cette étude par l’introduction de protéines Cas9 et deux complexes de la RNP CRISPR sgRNA pour induire la doubles brin pauses (CDB) et les segments de la suppression de l’intervenant. Cette méthode tire parti de l’utilisation de deux guides pour générer les destructions dans le cadre de lecture ouvert, rendement élevé de NHEJ menant à faible nombre de clones qu’il fallait être caractérisé et simple présélection des clones par le capillaire automatisé unité d’électrophorèse, analyseur de fragment. Ces génome efficaces méthodes pour générer des modèles de maladies humaines axée sur les cellules souches d’édition va bientôt devenir une approche standard et courante dans tout laboratoire de cellules souches. Enfin, génome précis édition rendra possible d’aller au-delà de modélisation de la maladie de cellules souches et potentiellement pourrait aider catalysent les thérapies à base cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reprogrammation de cellules somatiques humaines au CISP a donné un élan important aux champs de recherche de biologie fondamentale, médecine personnalisée, modélisation de maladies, développement des médicaments et la médecine régénérative,16. Nombreuses méthodes couramment utilisées de génération humaine iPSC nécessitent l’utilisation de virus, avec le risque d’intégration dans le génome hôte ou vecteurs épisomiques avec faible efficacité de reprogrammation. Nous présent…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Travail en laboratoire a été pris en charge par stage postdoctoral au Dr Anjali Nandal et bonifiée exploratoire du Maryland Stem Cell Research Fund à BT (TEDCO).
Materials
| Sendai viral vectors – CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Thaw on ice; S No: 1 |
| Trypsin EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0.05%, 100 ml; S No: 2 |
| Rock inhibitor (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Use 10 μM; S No: 3 |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
| Serum replacement (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
| DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S No: 6 |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30071.03 | Aliquot; S No: 7 |
| L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | 1/100; S No: 9 |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1,000; S No: 10 |
| Hausser Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
| 0.1% Gelatin Solution | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12 |
| SSEA-4 antibody | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
| TRA-1-81 antibody | Cell Signaling | 4745S | 1/200; S No: 14 |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1,000; S No: 15 |
| Collagen I, Rat Tail | Life Technologies | A10483-01 | Keep cold; S No: 16 |
| Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2,000; S No: 17 |
| DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | S No: 20 |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | S No: 21 |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | S No: 22 |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | S No: 23 |
| Picking hood | NuAire | NU-301 | S No: 24 |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | S No: 25 |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | S No: 29 |
| Prigrow III medium | ABM | TM003 | S No: 31 |
| Countess™ Cell Counter | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
| Faxitron X-ray system | Faxitron | CellRad | S No: 33 |
| Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S No: 34 |
| Collagenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S No: 35 |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37 |
| bFGF | R & D | 233-FB | Stock 10 ug/ml; S No: 38 |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S No: 39 |
| TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S No: 40 |
| NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
| Alkaline Phosphatase kit | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
| Cas9 protein | PNA Bio | CP01-50 | Thaw and aliquot; S No: 44 |
| Goat or donkey serum | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
| Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
| NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
| EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202T | S No: 51 |
| Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
| Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
| SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
| Fibronectin | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
| CloneJET cloning kit | Thermo Scientific | K1232 | S No: 56 |
| Fragment analyzerTM | Advanced Analytical | S No: 57 | |
| mTeSR1 medium kit | STEMCELL Technologies | 5850 | Warm to room temperature; S No: 58 |
| Freezing medium mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
| Freezing medium CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
| MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
| Human pancreatic cells | ABM | T0159 | S No: 63 |
| STEMdiff™ Neural Induction Medium | Stemcell Technologies | 5835 | S No: 64 |
| RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
| 2% B27-insulin | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
| CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
| IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
| 2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
| BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
| GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
| TUJ1 antibody | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
| NKX2-5 antibody | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
| SOX17 antibody | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
| Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
| FACSAria II (cell sorter) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |
Referenzen
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