효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집
Summary
이 CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins 및 수정된 된 특성을 사용 하 여 편집 다음 프로토콜 자세히 설명 발자국 없는 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대 급지대 무료 조건에서 인간의 췌장암 세포에서 단일 셀 복제합니다.
Abstract
배아와 유도 만능 줄기 세포는 자기 갱신 하 고 신체의 여러 세포 유형으로 차별화 수 있습니다. 만능 세포는 따라서 재생 의료에서 연구를 위한 탐 낼 고 현재 안과 질환, 당뇨병, 심장 질환 및 다른 질환에 대 한 임상 실험에서. 다양 한 응용 프로그램에 대 한 iPSC의 게놈을 조정 하기 위한 추가적인 기회를 제공 하는 편집 기술 CRISPR/Ca 시스템을 포함 하는 게놈의 최근 발전을 함께 하는 특수 세포 유형으로 차별화 하는 잠재력 모델링, 유전자 치료, 몇 가지 이름을 차별화의 경로 바이어 싱 하는 질병을 포함 하 여. 사용 가능한 편집 기술, 연쇄 상 구 균 pyogenes 에서 CRISPR/Cas9 진 핵 게놈의 사이트 편집에 대 한 선택의 도구로 떠오르고 있다. CRISPRs, 저렴, 쉽게 액세스할 수 있으며 대상된 편집 공학에서 매우 효율적인. Cas9 nuclease 및 가이드 시퀀스 (20-메 르)는 3 뉴클레오티드 “NGG” protospacer-인접-모티브 (PAM) 보편적인 Cas9 바인딩 추적 RNA (함께 원하는 genomic 소재 시에 Cas9을 타겟팅에 대 한 인접 게놈 대상에 특정 시스템 요구 함께 라는 단일 가이드 RNA 또는 sgRNA). 여기에 우리가 현재는 단계별 급지대 및 발자국 무료 iPSC의 효율적인 생성에 대 한 프로토콜 및 게놈 iPSC Cas9 ribonucleoprotein (RNP) 단지를 사용 하 여 편집에 대 한 방법론을 설명. 프로토콜 편집 게놈 효과적 이며 Cas9 단백질 및 동시에 전달 하는 셀에 하나 이상의 대상에 대 한 사전 complexing sgRNAs에 의해 쉽게 다중화 될 수 있다. 마지막으로, 우리는 식별 및 원하는 수정 Ipsc의 특성화에 대 한 간단한 접근 방법을 설명합니다. 함께 찍은, 개요 전략 생성 및 iPSC 매니폴드 응용 프로그램의 편집을 능률적으로 예상 된다.
Introduction
요소를 프로그래밍의 overexpression에 의해 만능 상태로 인간 체세포의 재프로그래밍 질병 모델링, 재생 의료 및 약물 개발에 응용 프로그램과 함께 줄기 세포 연구를 혁명 있다. 여러 가지 비 바이러스 성 재활 방법을 프로그래밍 요소와 Ipsc, 생성의 배달을 위해 사용할 수 있지만 과정은 노동 집약 하 고 매우 효율적인1. 바이러스 성 방법 비록 효율적 바이러스 통합 및 tumorigenicity2,,34의 문제와 관련 된 있습니다. 이 원고에서 우리 제공 요소를 프로그래밍 하 고 그들의 유전자5에 어떤 바이러스 성 벡터 시퀀스의 통합 부족 발자국 무료 iPSC 라인 설정에 대 한 세포질 센다이 바이러스를 사용 하 여를 보고 합니다. 센다이 바이러스는 RNA 바이러스는 감염 후 세포 세포질 ~ 10 구절에서 희석 하 고 풍부 하 게, 신속 하 고 효율적인 프로그래밍6,7을 선도 재활 요소를 생성 합니다. 설립된 Ipsc 공급기 무료 중간 급지대 셀8로 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs)의 사용을 피하기 위해 쉽게 전환 수 다음.
프로그래밍, 센다이 바이러스 중재 한 개요 뿐만 아니라이 책에서 우리 또한 원하는 유전자 수정 연구에 대 한 무제한 인간 세포를 공급 하는 Ipsc 편집에 대 한 향상 된 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 지금 노크 기능 및 녹아웃, 대규모 게놈 삭제, 유전자 검색, 유전자 공학에 대 한 심사는 풀링된 라이브러리를 포함 한 애플 리 케이 션의 광범위 한 사용 되는 Ipsc의 수정에 대 한 CRISPR/Cas9 기술 사용 수많은 모형 유기 체 및 유전자 치료9,,1011 이 기술은 포함 한다 연쇄 상 구 균 pyogenes의 단지의 형성-20-메 르 및 파생 Cas9 nuclease 가이드 RNAs 게놈 대상 시퀀스 3′ 뉴클레오티드 protospacer 인접 한에 인접 한 자료 연결을 통해 대상 인식 하기 위해 모티브 (PAM) 시퀀스입니다. Cas9 nuclease 유도 이후에 주로 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 통로 선도 삽입 또는 열려있는 독서 프레임에서 삭제 하 여 복구 하 고 그로 인하여 기능 팸 사이트에서 이중 좌초 휴식 ~ 3 뉴클레오티드 12유전자 녹아웃
인간의 췌 장 세포의 문화에 대 한 세부 정보를 포함 하는 우리의 향상 된 프로토콜, 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs) 프로그래밍, 피더 무료 문화 이후 적응의 높은 효율을 달성 하기 위해 비활성화 mitotically에 그들의 프로그래밍 Matrigel, 설립된 Ipsc의 특성에 CRISPR 가이드 RNA 설계 및 준비, RNP 단지, 단일 셀 정렬 편집된 Ipsc의 클론 라인 생성 하, 쉽게 심사 및 편집, 식별 및 특성으로 Ipsc에 배달 단일 셀 복제합니다. 게놈 삭제 했다 Cas9 단백질 및 두 배 좌초 틈 (DSBs) 유도 하 두 CRISPR sgRNA RNP 복합물의 도입으로 효율적으로이 연구에서 생성 되 고 삭제는 개입의 세그먼트. 이 메서드는 열려있는 독서 프레임에서 삭제를 생성 하기 위한 두 명의 가이드를 사용 하 여에 대문자로 바꿉니다, 그리고 고효율의 낮은 수 선도 NHEJ의 클론 자동된 모 세관에 의해 그 특성화 될 필요가 그리고 클론의 쉬운 예비 심사 전기 이동 법 단위, 조각 분석기입니다. 이러한 효과적인 게놈 인간 줄기 세포 기반 질병 모델을 생성 하는 방법을 편집 곧 모든 줄기 세포 실험실에서 표준 및 일상적인 접근을 될 것입니다. 마지막으로, 정확한 게놈 편집 그것은 줄기 세포 질병 모델링 넘어가 수 만들고 잠재적으로 촉매 세포 기반 치료를 도울 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ipsc 인간의 체세포의 재프로그래밍 기본적인 생물학 연구, 맞춤된 의학, 질병, 약물 개발 모델링과 재생 의학16의 분야에 큰 향상을 제공 하고있다. 호스트 게놈으로 통합의 위험 바이러스의 사용을 필요로 하는 인간의 iPSC 세대의 많은 현재 및 널리 사용 되는 방법 또는 episomal 벡터와 낮은 효율을 프로그래밍. 여기, 우리는 Ipsc 공급기 무료 센다이 바이러스, ‘ 무료 ‘와 효율적인 ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
실험실에서 박사 Anjali Nandal에 박사 후 펠로 십 그랜트와 탐험 그랜트에 의해 지원 되었다 메릴랜드 줄기 세포 연구 기금 BT (TEDCO)에서.
Materials
| Sendai viral vectors – CytoTune-iPS 2.0 Kit | Invitrogen | A16517 | Thaw on ice; S No: 1 |
| Trypsin EDTA | Gibco Life Tech | 25300-054 | 0.05%, 100 ml; S No: 2 |
| Rock inhibitor (Y-27632) | Milipore | SCM075 | Use 10 μM; S No: 3 |
| DMEM/F-12 medium | Invitrogen | 11330-032 | S No: 4 |
| Serum replacement (KSR) | Gibco | 10828028 | S No: 5 |
| DMEM | Invitrogen | 11960069 | 1X; S No: 6 |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30071.03 | Aliquot; S No: 7 |
| L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid | Thermo Scientific | 35050061 | 1/100; S No: 8 |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | 1/100; S No: 9 |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | 55 mM, 1/1,000; S No: 10 |
| Hausser Hemacytometers | Hausser Scientific | 02-671-54 | S No: 11 |
| 0.1% Gelatin Solution | STEMCELL Technologies | 7903 | Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12 |
| SSEA-4 antibody | Santacruz | sc-21704 | 1/100; S No: 13 |
| TRA-1-81 antibody | Cell Signaling | 4745S | 1/200; S No: 14 |
| OCT4 antibody | Santa Cruz | sc-5279 | 1/1,000; S No: 15 |
| Collagen I, Rat Tail | Life Technologies | A10483-01 | Keep cold; S No: 16 |
| Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) | Invitrogen | A21202/A10042 | 1/2,000; S No: 17 |
| DPBS | Hyclone | SH30028LS | 1X; S No: 18 |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | S No: 20 |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | S No: 21 |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | S No: 22 |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | S No: 23 |
| Picking hood | NuAire | NU-301 | S No: 24 |
| 15 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | S No: 25 |
| 50 ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 | S No: 26 |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360 | S No: 28 |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | S No: 29 |
| Prigrow III medium | ABM | TM003 | S No: 31 |
| Countess™ Cell Counter | Invitrogen | C10227 | S No: 32 |
| Faxitron X-ray system | Faxitron | CellRad | S No: 33 |
| Accutase | Innovative cell Technologies | AT-104 | S No: 34 |
| Collagenase | Life Technologies | 17104019 | 1mg/ml stock; S No: 35 |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | S No: 36 |
| hESC qualified matrigel | BD Biosciences | 354277 | To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37 |
| bFGF | R & D | 233-FB | Stock 10 ug/ml; S No: 38 |
| Paraformaldehyde | EMS | 15710 | 4% stock in PBS; S No: 39 |
| TRA-1-60 | Santa Cruz | sc-21705 | 1/100; S No: 40 |
| NANOG | ReproCELL | RCAB0004P-F | 1/100; S No: 41 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | S No: 42 |
| Alkaline Phosphatase kit | Stemgent | 00-0055 | S No: 43 |
| Cas9 protein | PNA Bio | CP01-50 | Thaw and aliquot; S No: 44 |
| Goat or donkey serum | Sigma | D9663/G9023 | S No: 45 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | S No: 46 |
| DAPI | Thermo Scientific | D1306 | S No: 47 |
| Tris | Sigma | 9285-100ML | S No: 48 |
| NaCL | Sigma | S7653-250G | S No: 49 |
| EDTA | Sigma | BP2482-500 | S No: 50 |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202T | S No: 51 |
| Mega Shortscript T7 kit | Thermo Scientific | AM1354 | S No: 52 |
| Mega Clear kit | Thermo Scientific | AM1908 | S No: 53 |
| SMC4 | BD Biosciences | 354357 | S No: 54 |
| Fibronectin | STEMCELL Technologies | 7159 | S No: 55 |
| CloneJET cloning kit | Thermo Scientific | K1232 | S No: 56 |
| Fragment analyzerTM | Advanced Analytical | S No: 57 | |
| mTeSR1 medium kit | STEMCELL Technologies | 5850 | Warm to room temperature; S No: 58 |
| Freezing medium mFreSR™ | STEMCELL Technologies | 5855 | S No: 59 |
| Freezing medium CryoStor® | STEMCELL Technologies | 7930 | S No: 60 |
| MEFs | Globalstem | GSC-6301G | S No: 61 |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | S No: 62 |
| Human pancreatic cells | ABM | T0159 | S No: 63 |
| STEMdiff™ Neural Induction Medium | Stemcell Technologies | 5835 | S No: 64 |
| RPMI | Thermofisher | 11875-093 | S No: 65 |
| 2% B27-insulin | Thermofisher | A1895601 | S No: 66 |
| CHIR99021 | Stemcell Technologies | 72052 | S No: 67 |
| IWP4 | Stemcell Technologies | 72552 | S No: 68 |
| 2% B27 | Thermofisher | 17504044 | S No: 69 |
| MCDB 131 | Life Technologies | 10372019 | S No: 70 |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8761-100ML | S No: 71 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | S No: 72 |
| BSA | Proliant | 68700 | S No: 73 |
| GDF8 | Pepro-Tech | 120-00 | S No: 74 |
| TUJ1 antibody | EMD Milipore | AB9354 | S No: 75 |
| NKX2-5 antibody | Santa Cruz | Sc-14033 | S No: 76 |
| SOX17 antibody | R & D systems | AF1924 | S No: 77 |
| Propidium iodide | Thermo Scientific | P3566 | S No: 78 |
| Amaxa 4D-nucleofector™ | Lonza | AAF-1002 | S No: 79 |
| FACSAria II (cell sorter) | BD biosciences | SORP UV | S No: 80 |
Referenzen
- Malik, N., Rao, M. S. A review of the methods for human iPSC derivation. Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Sommer, C. A., et al. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem cells. 27, 543-549 (2009).
- Macarthur, C. C., et al. Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions. Stem cells Int. , 564612 (2012).
- Li, H. O., et al. A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression. J Virol. 74, 6564-6569 (2000).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).
- Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci. Rep. 4, 3594 (2014).
- Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 169, 559 (2017).
- Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168, 20-36 (2017).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).
- McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).
- Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. BioTechniques. 59, (2015).
- Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. J Biotech. 241, 136-146 (2017).
