הערכת במבחנה נזק לדנ א שימוש Assay שביט
Summary
שביט וזמינותו היא שיטה יעילה לאיתור נזק לדנ א כולל יחיד, כפול גדילי ה-DNA שובר. אנו מתארים שביט אלקליין ונייטרלי מבחני למדוד נזק לדנ א בתאים סרטניים כדי להעריך את השפעת טיפולי כימותרפיה.
Abstract
נזק לדנ א היא תופעה נפוצה עבור כל תא במהלך תוחלת החיים שלה, מוגדר שינוי של המבנה הכימי של הדנ א. טיפולים בסרטן, כגון רדיו, כימותרפיה, להציג כמות עצומה של נזק לדנ א נוסף, המוביל אפופטוזיס של מחזור התא מעצר כדי להגביל את התקדמות סרטן. הערכה כמותית של נזק לדנ א במהלך טיפול ניסיוני בסרטן היא צעד המפתח כדי להצדיק את האפקטיביות של סוכן genotoxic. במחקר זה, אנו מתמקדים assay אלקטרופורזה תא בודד, ידוע גם בשם השביט וזמינותו, אשר יכולים לכמת יחיד, כפול-גדיל DNA שובר במבחנה. וזמינותו שביט היא שיטה כימות של ה-DNA נזק יעיל, קל לביצוע, ויש לו דרישות הזמן/תקציב נמוך ו הפארמצבטית גבוהה. כאן, אנחנו להדגיש את התועלת של שביט וזמינותו למחקר פרה על ידי הערכת אפקט genotoxic של טיפול משולב olaparib/temozolomide לתאים glioma U251.
Introduction
וזמינותו שביט פותחה לראשונה על ידי Ostling ג’והנסון בשנת 1984 על ידי הפגנת שההעברה של ה-DNA שברים הגרעינים תחת מצב ניטראלי1. הטכניקה פותחה מאוחר יותר על ידי סינג. et al., מראה כי תנאי בסיסי גדל באופן משמעותי את ירידה לפרטים ואת הפארמצבטית assay2. מאז, וזמינותו שביט ניטרלי משמש בעיקר כדי לזהות כפול גדילי DNA מעברי, בעוד וזמינותו שביט אלקליין רגיש יותר עבור כמויות קטנות יותר של ה-DNA נזק, לרבות יחיד כפול גדיל DNA שובר, אתרי אלקלי-יציב, DNA-DNA או חלבון-דנ א cross-linking, מעברי יחיד-גדיל DNA המשויך כריתה לא שלם תיקון אתרי3,4. שני מבחני לאפשר ויזואליזציה של DNA מפוצלים, מספקים דרך פשוטה באופן כמותי להעריך נזק לדנ א. וזמינותו שביט נחשבת שיטה רגישה מחקרים רעילות גנטיים בתוך חוץ גופית וויוו , החלים על שטחי מחקר שונים, כגון מבחר סמים-המועמד מוקדם, ניטור סביבתי, אפידמיולוגיה סביבתית אנושית, ו הבסיסית מחקר נזק לדנ א ותיקון5.
עקרון וזמינותו היא תחת שדה חשמלי, DNA מפוצלים נודד אל מחוץ לגוף נוקלאואיד (הידוע גם בשם “ראש שביט”) יוצרת כתם DNA הג’ל agarose (הידוע גם בשם “זנב השביט”). עם נוקלאוטיד מכתים, ניתן לכמת את מידת נזק לדנ א על-ידי ניתוח “שביט” שהוקמה על ידי אלקטרופורזה תא בודד זה. חישוב של הרגע הזנב יכול לסייע עוד יותר להשוות נזק לדנ א בין קבוצות שונות ניסיוני. לעומת שיטות מסורתיות של זיהוי ה-DNA נזק, וזמינותו שביט היא ישירה, רגיש, זולות, פשוטות יחסית.
הקרנות chemotherapies נמצאים אסטרטגיות נפוצות לטיפול בסרטן על ידי יצירת לחוט אחד, שובר זוגי גדיל DNA כרומוזום6. ההתקדמות האחרונה ב- DNA תיקון מעכבי מאפשר השפעה genotoxic יעיל יותר על-ידי שילוב כימותרפיה, לכן, פוטנציאל מפחית את תופעות מערכתיות כגון אנמיה, דלקת ו מח עצם דיכוי7, 8. במחקר זה, הראנו החקירה של מעכב פולימראז (PARP) פוליפוני (ADP-ריבוז), olaparib (אולה)9. PARP הוא חלבון גרעיני בשפע והוא אחראי על DNA כריתה הבסיס לתקן על ידי יצירת פולימר פוליפוני (ADP-ריבוז)10. Temozolomide (TMZ) הוא סוכן החומר זמין, כבר בשימוש נרחב לטיפול החולה glioma. באמצעות וזמינותו שביט לכמת נזק לדנ א, נדגים שילוב olaparib עם temozolomide עמוקות מגבירה את הנזק ה-DNA בתאי glioma, אשר מציע טיפול משולב olaparib/temozolomide היא אסטרטגיית יעיל לטיפול glioma, לעומת לבד temozolomide11.
Protocol
Representative Results
Discussion
וזמינותו שביט הוא כלי יעיל למדידת יחיד כפול-גדיל DNA ומעברי ברמה התאית. וזמינותו הוחל נרחב בתור “תקן הזהב” מחקרים בנוגע genotoxicity, אפידמיולוגיה סביבתית13, החל נגעים הבסיס, DNA crosslinks, פיתוח תרופות, ואתרים אלקליות רגיש. במחקר הנוכחי, הראנו שני פרוטוקולים ברורים צעד אחר צעד עבור מבחני שב?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר מגזר של NIH, NCI, CCR. כל המחברים קיבל מענק מחקר מגזר NIH, NCI, CCR.
Materials
| Reagents | |||
| 10x PBS(Ca++, Mg++ free) | TEKnova | P0196 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| EDTA | TEKnova | E0308 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| NaOH | Sigma | 72068 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Sigma | L7414 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
| Sodium acetate | Sigma | 32318 | |
| Glacial acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Ammonium acetate | Sigma | A1542 | |
| SYBR Green | Invitrogen | S33102 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500 | |
| 95% ethanol | WARNER-GRAHAM | #64-17-5 | |
| Trypsin | GIBICO | 25300-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Glass tissue slides | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 63422-11 | |
| Kimwipes | KIMberly-Clark | ||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | DENVILLE | ||
| Pipette Tips | SHARP | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Microwave | Avanti | ||
| Waterbath | PRECISION | ||
| Horizontal electrophoresis chamber | TREVIGEN | Cometassay ES II | |
| Power supply | Bio-Rad | ||
| Incubator | Quincy Lab | Model 12-140E | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Micropipettor | Eppendorf |
Referenzen
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
- Tice, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).
- Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays. Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).
- Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).
- Goldstein, M., Kastan, M. B. The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy. Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).
- Gavande, N. S., et al. DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment?. Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).
- Torgovnick, A., Schumacher, B. DNA repair mechanisms in cancer development and therapy. Front Genet. 6, 157 (2015).
- Weston, V. J., et al. The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo. Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).
- Brown, J. S., O’Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors. Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).
- Lu, Y., et al. Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair. Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).
- Konca, K., et al. A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay. Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).
- Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Karbaschi, M., Cooke, M. S. Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay. Sci Rep. 4, 7200 (2014).
