Evaluar In Vitro el daño de ADN utilizando el ensayo cometa

Summary

El ensayo cometa es un método eficiente para detectar daños en el ADN como sola y doble hebra de ADN se rompe. Se describen ensayos cometa alcalino y neutral para medir el daño del ADN en células de cáncer para evaluar el efecto terapéutico de la quimioterapia.

Abstract

Daños en el ADN es un fenómeno común para cada celda durante su vida útil y se definición como una alteración de la estructura química de la DNA genomic. Tratamientos contra el cáncer, tales como radio y quimioterapia, introduce gran cantidad de daño de ADN adicional, llevando a la detención del ciclo celular y apoptosis para limitar la progresión del cáncer. Evaluación cuantitativa del daño de la DNA durante la terapia experimental del cáncer es un paso clave para justificar la eficacia de un agente genotóxico. En este estudio, nos centramos en un análisis de electroforesis unicelular, también conocido como el ensayo del cometa, que puede cuantificar solo y doble cadena ADN rompe en vitro. El ensayo cometa es un método de cuantificación de daños de ADN que es eficiente y fácil de realizar, y tiene demandas de tiempo y dentro de presupuesto bajo y alta reproducibilidad. Aquí, destacamos la utilidad del ensayo cometa para un estudio preclínico por evaluar el efecto genotóxico de la terapia de combinación de olaparib/temozolomida a las células de glioma U251.

Introduction

El análisis del cometa primero fue desarrollado por Ostling y Johanson en 1984 demostrando que la migración del ADN de fragmentos de los núcleos en un estado neutro¹. La técnica fue desarrollada más tarde por Singh et al., mostrando que una condición alcalina aumenta sustancialmente la especificidad y la reproducibilidad del ensayo². Desde entonces, el análisis del cometa neutro se utiliza sobre todo para detectar roturas de la DNA de doble cadena, mientras que el ensayo del cometa alcalino es más sensible para cantidades más pequeñas de daño en el ADN, incluyendo solo y doble cadena de ADN rompe, sitios álcali lábil, DNA-DNA o Cross-linking de la proteína ADN y rupturas monocatenarias de DNA asociadas con la supresión incompleta de reparación sitios^3,4. Ambos ensayos permiten visualización de ADN fragmentado y proporcionan una manera sencilla de evaluar cuantitativamente el daño de la DNA. El análisis del cometa es considerado como un método sensible para estudios toxicológicos genéticos in vitro e in vivo y es aplicable a las áreas de investigación, tales como la selección precoz candidato a fármaco, monitoreo ambiental, control biológico humano, y fundamental de investigación en daño de la DNA y reparación⁵.

El principio del ensayo es que bajo un campo eléctrico, el DNA fragmentado migra fuera del cuerpo de nucleoid (también conocido como la “cabeza de cometa”) y forma una mancha de ADN en el gel de agarosa (también conocido como la “cola de cometa”). Con nucleótidos la coloración, el grado de daño del ADN puede cuantificarse mediante el análisis de “cometas” formados por esta electroforesis unicelular. Cálculo del momento de cola más puede ayudar a comparar los daños en el ADN entre los diferentes grupos experimentales. En comparación con los métodos tradicionales de detección de daño de ADN, el análisis del cometa es directa, sensible, barato y relativamente sencillo.

Radioterapia y quimioterapias son estrategias comunes para el tratamiento del cáncer mediante la generación de hebra y ADN de doble cadena se rompe en los cromosomas⁶. El avance reciente de inhibidores de la reparación de ADN permite un más eficaz efecto genotóxico por quimioterapia de combinación y por lo tanto, reduce los efectos secundarios sistémicos tales como anemia, infección y la médula ósea supresión^{7, 8}. en este estudio, mostramos la investigación de un inhibidor de poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), olaparib (Ola)⁹. PARP es una proteína nuclear abundante y es responsable de la reparación de la base de la supresión de ADN mediante la formación de un polímero de poli (ADP-ribosa)¹⁰. La temozolomida (TMZ) es un agente alquilante oral disponible y ha sido ampliamente utilizado para el tratamiento de pacientes de glioma. Utilizando el ensayo cometa para cuantificar daños en el ADN, demostramos que combina olaparib con temozolomida profundamente mejora el daño de la DNA en células de glioma, que sugiere terapia combinada olaparib/temozolomida es una estrategia eficaz para tratar el glioma, en comparación con temozolomida sólo¹¹.

Protocol

1. preparar reactivos 1 x PBS diluir 100 mL 10 x PBS con 900 mL dH 2 O y ajustar el pH a 7.4 con un medidor de pH. Almacenar a temperatura ambiente. Solución de lisis (LS) preparar 2.5 M NaCl, 100 mM disódico EDTA, 10 mM Tris base y 200 mM NaOH en 900 mL dH 2 O; comúnmente tarda unos 20 minutos para permitir que la mezcla se disuelva completamente. Ajustar el pH a 10 con un medidor de pH. Agregar 1% Sodio Lauril sar…

Representative Results

El presente Protocolo describe un flujo de trabajo paso a paso para la ejecución del ensayo de cometa y análisis de datos (figura 1). Resultados de los ensayos de comet alcalino y neutro mostraron que la cola del cometa de doxorrubicina-U251 las células tratadas (1 μm, 20 h) era más largo y tenía mayor intensidad de ADN, lo que sugiere una sustancial acumulación de ADN fragmentado debido a la quimioterapia (figura 2). …

Discussion

El ensayo cometa es una herramienta eficaz para medir solo y doble cadena roturas del ADN a nivel celular. El ensayo se ha aplicado extensamente como un “estándar de oro” en los estudios sobre genotoxicidad y biomonitoreo¹³, que van desde lesiones de base ADN reticulaciones, desarrollo de fármacos y sitios sensibles de álcali. En el presente estudio, hemos mostrado dos protocolos distintos paso a paso para los ensayos de comet alcalino y neutro, respectivamente. Combinación de electroforesis u…

Materials

Reagents
10x PBS(Ca++, Mg++ free)	TEKnova	P0196
NaCl	Sigma	S5886
EDTA	TEKnova	E0308
Trizma base	Sigma	T1503
NaOH	Sigma	72068
Sodium lauryl sarcosinate	Sigma	L7414
Triton X-100	Sigma	93443
Sodium acetate	Sigma	32318
Glacial acetic acid	Sigma	695092
Ammonium acetate	Sigma	A1542
SYBR Green	Invitrogen	S33102
Low melting point agarose	Invitrogen	16520
Agarose	Invitrogen	16500
95% ethanol	WARNER-GRAHAM	#64-17-5
Trypsin	GIBICO	25300-054
Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Glass tissue slides	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	63422-11
Kimwipes	KIMberly-Clark
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	DENVILLE
Pipette Tips	SHARP
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Microwave	Avanti
Waterbath	PRECISION
Horizontal electrophoresis chamber	TREVIGEN	Cometassay ES II
Power supply	Bio-Rad
Incubator	Quincy Lab	Model 12-140E
Fluorescent microscope	Zeiss	LSM700
Micropipettor	Eppendorf