Оценки в Vitro повреждения ДНК, используя Assay комета
Summary
Assay комета является эффективным методом для обнаружения повреждения ДНК, включая одиночные и двуцепочечной ДНК разрывами страниц. Мы описываем щелочных и нейтральных комета анализов для определения повреждения ДНК в раковых клетках оценить терапевтический эффект химиотерапии.
Abstract
Повреждение ДНК является обычным явлением для каждой ячейки во время его жизни и определяется как изменение химического состава геномной ДНК. Лечения рака, такие как радио – и химиотерапии, ввести огромное количество дополнительных повреждений ДНК, ведущих к арест клеточного цикла и апоптоз ограничить прогрессии рака. Количественная оценка повреждения ДНК в ходе экспериментальной рака терапии является ключевым шагом для обоснования эффективности генотоксичных агента. В этом исследовании мы ориентируемся на одну ячейку электрофорез assay, также известный как assay кометы, которые могут количественно охарактеризовать одной и ДНК двухнитевые разрывы в пробирке. Assay комета является метод количественной оценки повреждения ДНК, который является эффективным и легко выполнять, и имеет низкий бюджет времени требованиями и высокую воспроизводимость. Здесь мы подчеркнуть полезность комета assay доклинические исследования, оценивая эффект генотоксичных olaparib/Темозоламид комбинированной терапии для U251 клеток глиомы.
Introduction
Assay комета была впервые разработана Остлинг и Йохансон в 1984 году, продемонстрировав, что миграция ДНК фрагменты из ядер под нейтральной условие1. Техника позднее был разработан Singh et al., показаны, что щелочной значительно увеличила специфичность и воспроизводимость пробирного2. С тех пор, пробирного нейтральных кометы в основном используется для обнаружения двуцепочечные разрывы ДНК, в то время как assay щелочной комета является более чувствительным для небольших сумм повреждения ДНК, включая одноместные и двойной нити ДНК влезает, щелочно лабильного сайтов, ДНК-ДНК или ДНК белковых сшивки и разрывы сингл нить ДНК, связанные с неполной иссечение ремонт сайтов3,4. Оба анализы позволяют визуализации фрагментированных ДНК и предоставляют простой способ количественно оценить повреждение ДНК. Комета рассматривается как чувствительный метод для в пробирке и в vivo генетических токсикологических исследований и применим для различных научно-исследовательских областях, таких как раннего отбора наркотиков кандидат, мониторинг окружающей среды, человеческого биомониторинга, и фундаментальные исследования в повреждения ДНК и ремонт5.
Принцип анализа, что под электрического поля, раздробленной ДНК мигрирует из nucleoid тела (также известный как «голова кометы») и формирует пятно ДНК в агарозном геле (также известный как «хвост кометы»). С нуклеотидом окрашивание, степень повреждения ДНК может быть определена количественно, анализируя «кометы» сформировал электрофорезом этой одной ячейки. Далее расчет момента хвост может помочь сравнить повреждение ДНК среди различных экспериментальных групп. По сравнению с традиционными методами обнаружения повреждения ДНК, комета assay прямой, чувствительных, недорогой и относительно простой.
Лучевой терапии и химиотерапии являются общие стратегии для лечения рака, создавая одинарная и двойная нить ДНК перерывы в хромосом6. Недавние улучшения в ремонт Ингибиторы ДНК позволяет более эффективным генотоксичных эффект химиотерапии и поэтому потенциально сокращает системные побочные эффекты, такие как анемия, инфекции и костного подавления7, 8. в этом исследовании, мы показали расследования ингибитор поли (АДФ рибоза) полимеразы (ПАРП), olaparib (УПВ)9. ППА является обильным ядерных белков и отвечает за базовые иссечение репарации ДНК путем формирования поли (АДФ рибоза) полимер10. Темозоламид (ТМЗ) является алкилирующим агентом, устно доступных и широко используется для лечения пациентов глиомы. Используя комета assay для количественного определения повреждения ДНК, мы демонстрируем, что сочетание olaparib с Темозоламид глубоко повышает повреждение ДНК клеток глиомы, который предполагает, что olaparib/Темозоламид комбинированной терапии является эффективной стратегией для лечения глиомы, по сравнению с Темозоламид только11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Assay комета является эффективным инструментом для измерения одно и двухнитевые разрывы ДНК на клеточном уровне. Assay широко применяется как «золотой стандарт» в исследованиях о генотоксичности и биомониторинга13, начиная от базового поражений, сшивки ДНК, разработки лекарст…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано интрамуральных исследовательской программы NIH, NCI и CCR. Все авторы получили интрамуральных исследовательский грант от НИЗ, NCI и CCR.
Materials
| Reagents | |||
| 10x PBS(Ca++, Mg++ free) | TEKnova | P0196 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| EDTA | TEKnova | E0308 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| NaOH | Sigma | 72068 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Sigma | L7414 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
| Sodium acetate | Sigma | 32318 | |
| Glacial acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Ammonium acetate | Sigma | A1542 | |
| SYBR Green | Invitrogen | S33102 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500 | |
| 95% ethanol | WARNER-GRAHAM | #64-17-5 | |
| Trypsin | GIBICO | 25300-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Glass tissue slides | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 63422-11 | |
| Kimwipes | KIMberly-Clark | ||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | DENVILLE | ||
| Pipette Tips | SHARP | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Microwave | Avanti | ||
| Waterbath | PRECISION | ||
| Horizontal electrophoresis chamber | TREVIGEN | Cometassay ES II | |
| Power supply | Bio-Rad | ||
| Incubator | Quincy Lab | Model 12-140E | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Micropipettor | Eppendorf |
Referenzen
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
- Tice, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).
- Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays. Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).
- Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).
- Goldstein, M., Kastan, M. B. The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy. Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).
- Gavande, N. S., et al. DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment?. Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).
- Torgovnick, A., Schumacher, B. DNA repair mechanisms in cancer development and therapy. Front Genet. 6, 157 (2015).
- Weston, V. J., et al. The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo. Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).
- Brown, J. S., O’Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors. Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).
- Lu, Y., et al. Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair. Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).
- Konca, K., et al. A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay. Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).
- Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Karbaschi, M., Cooke, M. S. Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay. Sci Rep. 4, 7200 (2014).
