Mesure de la déformabilité et hétérogénéité des globules rouges dans le sang par ektacytomètre
Summary
Nous présentons ici les techniques pour mesurer la déformabilité des globules rouges et l’hétérogénéité cellulaire par ektacytomètre. Ces techniques sont applicables pour des enquêtes générales de la déformabilité des globules rouges et des enquêtes spécifiques sur les maladies du sang caractérisées par la présence d’hématies rigides et déformables en circulation, telles que l’anémie falciforme.
Abstract
Une diminution des globules rouges déformabilité est caractéristique de plusieurs troubles. Dans certains cas, la mesure de la déformabilité défectueuse peut prédire la gravité de la maladie ou la survenue de complications graves. Ektacytomètre utilisations laser viscosimétrie de diffraction pour mesurer la déformabilité des globules rouges, soumise à la contrainte de cisaillement croissante ou un gradient osmotique à une valeur constante de cisaillement appliquée. Toutefois, les mesures directes de la déformabilité sont difficiles à interpréter lors de la mesure sanguine hétérogène qui se caractérise par la présence d’hématies rigides et déformables. Cela est dû à l’incapacité des cellules rigides pour aligner correctement en réponse à la contrainte de cisaillement et de résultats dans un schéma de diffraction déformée, marquée par une baisse exagérée dans la capacité de déformation apparente. Mesure du degré de distorsion fournit un indicateur de l’hétérogénéité des érythrocytes dans le sang. Dans l’anémie falciforme, c’est en corrélation avec le pourcentage de cellules rigides, qui reflète la concentration d’hémoglobine et de la composition de l’hémoglobine des érythrocytes. En plus de mesurer la capacité de déformation, ektacytomètre gradient osmotique fournit des informations sur la fragilité osmotique et l’état d’hydratation des érythrocytes. Ces paramètres reflètent également la composition de l’hémoglobine des globules rouges de patients drépanocytaires. Ektacytomètre mesure de la déformabilité des populations de globules rouges et donc, logiciel ne fournit pas d’informations sur la déformabilité ou les propriétés mécaniques des érythrocytes individuels. Malgré tout, le but des techniques décrites dans les présentes est de fournir une méthode pratique et fiable pour mesurer la déformation et l’hétérogénéité cellulaire du sang. Ces techniques peuvent être utiles pour le suivi des changements temporels, ainsi que la progression de la maladie et réponse à l’intervention thérapeutique dans plusieurs troubles. L’anémie falciforme est un exemple bien caractérisé. Autres troubles potentiels où les mesures de déformabilité des hématies et/ou d’hétérogénéité sont d’intérêt comprennent la conservation du sang, diabète, infection à Plasmodium , carence en fer et les anémies hémolytiques en raison de défauts de la membrane.
Introduction
Ektacytomètre fournit une mesure pratique de la déformabilité des globules rouges en réponse à des altérations dans la contrainte de cisaillement (mesurée en pascals (Pa)) ou en suspendant l’osmolalité moyenne. Les paramètres pertinents de la déformabilité des globules rouges comprennent l’index de l’élongation maximale (Max AE), une mesure de la capacité de déformation maximale d’un globule rouge à la suite de plus en plus contrainte de cisaillement et contrainte de cisaillement ½ (SS ½), la contrainte de cisaillement nécessaire pour atteindre la moitié maximale déformabilité. 1 ektacytomètre gradient osmotique possède plusieurs paramètres informatifs. Il s’agit de l’indice élongation minimale (Min AE), une mesure du rapport surface-volume et l’osmolalité auquel elle produit (O Min), qui est une mesure de la fragilité osmotique. Max de l’IE et l’osmolalité auquel elle produit (O (a.-E Max)) renseignent sur la membrane flexibilité et cellule superficie. Moitié élongation maximale du bras hypertonique du gradient osmotique est représentée par l’IE hyper. AE hyper et l’osmolalité auquel il se produit, O hyper, fournissent des informations sur la viscosité intracellulaire de l’hématie qui est déterminée par la concentration d’hémoglobine. 2 , 3 la déformabilité de mesure dans le sang hétérogène est compliquée par le fait que les cellules rigides, comme les globules rouges falciformes, ne sont pas correctement alignent avec le sens de circulation telles que les cellules déformables en réponse à l’augmentation de la contrainte de cisaillement. Plutôt que de produire une image caractéristique de diffraction elliptique, rigides cellules produisent un modèle sphérique qui se traduit par un patron de diffraction en forme de losange lorsque superposées sur l’ellipse, produite par des cellules déformables. 4 , 5 , 6 le modèle sphérique s’est avéré correspondent aux cellules falciformes irréversiblement en exécutant ektacytomètre sur les fractions isolées de cellules après centrifugation de densité. 6 le calcul de l’indice élongation comprend des mesures sur l’axe de l’ellipse ; les deux long et court un losange a donc produit une diminution apparente de l’élongation en augmentant la largeur de l’axe court. 7 il a été précédemment montré que le degré de distorsion de patron de diffraction est corrélé avec le pourcentage de l’hémoglobine (HbS) de la faucille et le pourcentage de cellules falciformes dans le sang de patients atteints de drépanocytose. 5 le degré de distorsion de patron de diffraction peut être obtenu par des analyses mathématiques complexes. 8 il peut aussi être obtenu en réglant l’ouverture de l’ouverture de la caméra sur l’ektacytometer ou le niveau de gris du logiciel montage pour modifier la hauteur de patron de diffraction. 5 Toutefois, détails concernant la façon d’ajuster le niveau de gris ne sont pas bien définies et l’ouverture de l’appareil photo n’est pas facilement accessible sur la dernière génération de l’ektacytometer disponible dans le commerce. Pour contourner ces problèmes, le gain de la caméra facilement accessible peut être utilisé pour ajuster des hauteurs de patron de diffraction. 9 à l’aide de cette méthode pour estimer l’hétérogénéité cellulaire, le degré de distorsion de patron de diffraction peut être corrélé avec le pourcentage d’hémoglobine foetale dans le sang des patients atteints de drépanocytose. 10 plusieurs paramètres ektacytomètre gradient osmotique sont également corrélées avec le pourcentage de foetus ou faucille d’hémoglobine dans le sang de patients atteints de drépanocytose. Diffraction distorsion corrélations susceptibles de reflétant la contribution de la composition de l’hémoglobine pour le pourcentage de cellules rigides, indéformable. D’intérêts supplémentaires, le profil de toute ektacytomètre gradient osmotique subit des changements de biphasique qui correspondent au pourcentage de cellules denses en circulation au cours de la crise de la drépanocytose. 11
Ektacytomètre est également utile dans l’étude de plusieurs autres troubles. Ektacytomètre gradient osmotique permet de diagnostiquer les troubles de membrane héréditaire des globules rouges, comme la Sphérocytose héréditaire, elliptocytose héréditaire et pyropoikilocytosis héréditaire. 3 , 12 , 13 , 14 la déformabilité réduite se produit dans une carence en fer. 15 la caractérisation de la lésion « stockage » du sang a employé ektacytomètre et futures études portant sur la nature de la lésion et interventions visant à prévenir sa formation lors du stockage du sang mis en banque est susceptibles de bénéficier de la techniques présentées ici. 16 la déformabilité érythrocytaire diminuée a aussi été corrélée avec maladie microvasculaire chez les diabétiques. 17 études récentes qui relie l’hyperglycémie, érythrocytaire ascorbate et fragilité osmotique suggèrent que ces facteurs peuvent être importants dans le développement de la maladie microvasculaire. 18 ektacytomètre études sont actuellement en cours pour étudier cette hypothèse (Parrow et Levine, données inédites). Paludisme de la scène sang est une autre avenue intéressante des enquêtes de déformabilité des globules rouges. Déformabilité cellulaire de Plasmodium falciparum infectés de globules rouges diminue considérablement au cours des 48 heures de maturation intracellulaire du parasite du stade de l’anneau au stade schizonte. Éléments de preuve indiquent que cette diminution de la déformabilité est renversée par la maturation du parasite. L’inversion coïncide avec la libération des hématies infectées dans la circulation. Une diminution de la déformabilité est pensée pour être médiée par des protéines de Plasmodium qui favorisent la sequestration du globule rouge. 19 ces études portent sur un petit échantillon des conditions cliniquement importantes où la mesure déformabilité des érythrocytes et des paramètres de gradients osmotiques sont pertinentes. Il existe plusieurs domaines d’étude complémentaires.
Les autres techniques pour mesurer la déformabilité des globules rouges incluent des pinces optiques (également connus comme pièges laser) qui utilisent les propriétés physiques des photons d’étirer unique des globules rouges dans une ou plusieurs directions. 20 cette technique a l’avantage de la mesure de la déformabilité des érythrocytes unique, mais une incertitude dans l’étalonnage de la force a produit une variabilité considérable dans l’ensemble des études 21 et analyse des données peut être fastidieux à moins que automatisé. 22 aspiration micropipette, qui utilise une pression négative pour aspirer un érythrocyte dans une micropipette, a également été utilisée pour mesurer la déformabilité des globules rouges. 7 , 23 mesures multiples, tels que la pression nécessaire pour aspirer les globules rouges, sont possibles avec chaque mesure définissant les différentes caractéristiques du globule rouge. 23 la microscopie à force atomique est une technique de haute résolution qui mesure la rigidité de la membrane en quantifiant la déflexion du faisceau laser comme indicateur de flexion en porte-à-faux le long de la surface d’un globule rouge. 24 ces techniques fournissent des informations sur les érythrocytes individuels, ne sont pas facilement adapté pour mesurer l’évolution des populations de globules rouges et, en général, nécessitent une expertise technique considérable.
Le désir de goûter individuel et des populations de cellules simultanément a conduit à des progrès dans l’automatisation et le développement de la microfluidique et des méthodes axées sur le tableau. Comme ektacytomètre, rheoscopy mesures de déformation en fonction de la contrainte de cisaillement, mais les images sont acquises directement par l’intermédiaire de microscope. 25 pour plus élevée à travers-put analyses, imagerie cellulaire automatisée a été employé pour produire des distributions de déformabilité utilisant le rheoscope. 26 hétérogénéité cellulaire peut être mesurée par cette méthode si les données d’un sujet sain de contrôle sont disponibles. 27 techniques microfluidiques permettent aussi élevée à travers-put analyses des cellules simples ; conceptions multiples à l’aide des adaptations de filtration, analyseurs de transit cellule28 ,29 , qui mesure le temps requis pour un érythrocyte traversent une micropore et qui mesurent la pression nécessaire pour le transit des érythrocytes plutôt des solutions de rechange que temps, 30 ont été développées. Une autre plate-forme pour élevée à travers-put analyse de cellules individuelles est la puce de tableau de microchamber cellule unique, qui a l’avantage supplémentaire de permettre en aval caractérisation basés sur la fluorescence des cellules. 31 bien que chacune de ces techniques peut être utile et peut être supérieur pour des applications particulières, les avantages comparatifs des ektacytomètre comprend la sensibilité, simplicité d’utilisation et précision. 32 la dernière génération d’ektacytometers disponible dans le commerce possède également une polyvalence considérable du nombre de tests pouvant être effectués.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les ektacytomètre techniques décrites sont simples et bien automatisé, assurant des résultats valables et reproductibles. Néanmoins, il existe quelques étapes cruciales. Contrôle de la température correcte du sang est important. Stockage à température ambiante pendant plus de huit heures peut affecter SS ½ valeurs. 34 s’assurer que la température de la machine est stable à 37 ° C est également important, comme la viscosité du milieu à suspension est dépendante de la températur…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros de la National Institutes of Diabetes, digestif et maladies rénales et National Heart, Lung and Blood Institute des National Institutes of Health. Les opinions exprimées ici sont la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.
Materials
| LoRRca MaxSis standard version | Mechatronics | LORC109000 | |
| LoRRca MaxSis Osmoscan | Mechatronics | LORC109001 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm | Mechatronics | QRR030910 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm | Mechatronics | QRR030930 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials | Mechatronics | QRR030901 | |
| X clean | Mechatronics | QRR010946 | |
| P1000 | MilliporeSigma | Z646555 | |
| P200 | MilliporeSigma | Z646547 | |
| P200 filter tips | MidSci | AV200-H | |
| P1250 filter tips | MidSci | AV1250-H | |
| Kimwipes | MidSci | 8091 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| 15 mL conical vial | MidSci | C15R |
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