Измерения деформируемости и неоднородность эритроцитов в крови, Ektacytometry
Summary
Здесь мы представляем методы оценки деформируемости эритроцитов и гетерогенность клеточных ektacytometry. Эти методы применяются для общего исследования деформируемости эритроцитов и конкретные исследования заболеваний крови, характеризуется наличием жесткой и деформируемого красных клеток в обращении, как серповидно-клеточная анемия.
Abstract
Снижение эритроцитов деформируемости характерно несколько расстройств. В некоторых случаях масштабы дефектных деформируемости может предсказать тяжести заболевания или возникновения серьезных осложнений. Ektacytometry использует Лазерный дифракционный вискозиметрия измерить деформируемость эритроцитов при условии увеличения напряжения сдвига или осмотический градиент на постоянное значение приложенного напряжения сдвига. Однако измерения прямого деформируемости трудно интерпретировать при измерении разнородные крови, которое характеризуется наличием жесткой и деформируемого красных клеток. Это обусловлено жесткой клеток неспособность правильно согласовать в ответ касательное напряжение и результаты в искаженной дифракционный рисунок отмечен преувеличенные снижением очевидной деформируемости. Измерение степени искажения обеспечивает показатель гетерогенности эритроцитов в крови. В серповидно-клеточная анемия это связано с доля жесткой клеток, который отражает концентрацию гемоглобина и состав гемоглобина в эритроцитах. Помимо измерения деформируемости, осмотический градиент ektacytometry предоставляет сведения о осмотической хрупкости и гидрации эритроцитов. Эти параметры также отражать состав гемоглобин красных кровяных клеток от Серп клеток пациентов. Ektacytometry меры деформируемости популяции красных клеток и, таким образом, представлять информацию о деформируемости или механических свойств отдельных эритроцитов. Независимо от того методов, описанных в данном документе призвана обеспечить удобный и надежный способ для измерения деформируемости и клеточных неоднородность крови. Эти методы могут быть полезны для мониторинга временных изменений, а также прогрессирования заболевания и реакции для терапевтической интервенции в несколько расстройств. Серповидноклеточная анемия является одним из хорошо известных примеров. Другие потенциальные расстройств, где измерения деформируемости эритроцитов и/или неоднородности представляют интерес включают хранения крови, диабет, инфекции Plasmodium , дефицит железа и гемолитической анемии вследствие дефектов мембраны.
Introduction
Ektacytometry обеспечивает удобный мера деформируемости эритроцитов в ответ на изменения в касательное напряжение (измеряется в паскалях (ПА)) или приостановления средних осмотического давления. Соответствующие параметры деформируемости эритроцитов включают индекс Максимальное удлинение (EI Макс), мера максимального деформируемость эритроцитов в ответ на растущее напряжение сдвига и напряжение сдвига ½ (SS ½), касательное напряжение, необходимых для достижения половину максимального деформируемости. 1 осмотический градиент ektacytometry имеет несколько информативных параметров. Они включают минимальный индекс удлинения (EI мин), мера отношение поверхности к объему и осмотического давления, при котором это происходит (O мин), которая является мерой осмотической хрупкости. EI Макс и осмотического давления, при котором это происходит (O (EI Макс)) представить информацию о площади поверхности мембраны гибкость и клеток. Половина Максимальное удлинение в гипертонический руку осмотического градиента представлена EI гипер. EI гипер и осмотического давления, при котором это происходит, O гипер, предоставить информацию о внутриклеточной вязкость эритроцитов, которая определяется концентрация гемоглобина. 2 , 3 измерение деформируемости в гетерогенных крови осложняется тем, что жесткие клеток, таких как sickled красных кровяных клеток, не правильно выровнять с направлением потока например деформируемого клетки в ответ на увеличение напряжения сдвига. А не производя характерный эллиптической дифракции изображения, жесткой клетки производят сферические шаблон, который приводит в ромбовидной дифракционный рисунок при наложении на эллипс, производимые деформируемые ячейки. 4 , 5 , 6 сферической модели было показано, чтобы соответствовать необратимо sickled клетки, выполняя ektacytometry на отдельные фракции после центрифугирования плотность клеток. 6 расчет индекса удлинение включает меры, длинной и короткой оси эллипса; ромб поэтому производит очевидное снижение относительного удлинения, увеличивая ширину короткой оси. 7 ранее показано, что степень искажения модели дифракции соотносится с процент гемоглобина серпа (ХБС) и доля sickled клеток в крови пациентов с серповидно-клеточная анемия. 5 степень искажения модели дифракции может быть получено сложного математического анализа. 8 она может быть также получена путем корректировки открытия диафрагмы на ektacytometer или серый уровень установку программного обеспечения, чтобы изменить высоту модели дифракции. 5 однако, подробности о том, как настроить уровень серого не хорошо определены и диафрагмы не является легко доступной на последнего поколения коммерчески доступных ektacytometer. Чтобы обойти эти проблемы, легко доступные камеры выгоды может использоваться для регулировки высоты картина дифракции. 9 использование этого метода для оценки сотовой неоднородность, степень искажения модели дифракции может быть соотнесена с процентом фетального гемоглобина в крови больных с серповидно-клеточная анемия. 10 несколько параметров осмотический градиент ektacytometry также коррелируют с долей плода или серп гемоглобина в крови у больных с серповидно-клеточная анемия. Дифракционной картины искажения корреляции вероятно отражают вклад состав гемоглобина процент жесткая, не деформируемым клеток. Дополнительный интерес весь осмотический градиент ektacytometry профиль подвергается двухфазный изменения, которые соответствуют процент плотной клеток в обращении во время кризиса Серповидноклеточная. 11
Ektacytometry также полезны в изучении нескольких других расстройств. Осмотический градиент ektacytometry диагностики для унаследованного эритроцитарной мембраны расстройств, таких как наследственной сфероцитоза, наследственный elliptocytosis и наследственной pyropoikilocytosis. 3 , 12 , 13 , 14 деформируемости сокращение происходит в железодефицитной анемии. 15 характеристика «хранения поражения» крови использовала ektacytometry и будущих исследований, изучения как характер поражения и вмешательства для предотвращения его формирования во время хранения накренился крови могут извлечь выгоду из представленные здесь методики. 16 Уменьшившийся деформируемости эритроцитов также были коррелирует с микрососудистой заболевания диабета. 17 недавних исследований, связывающих гипергликемии, концентрации аскорбата эритроцитов и осмотической хрупкости предлагаю эти факторы могут быть важным в развитии микрососудистой болезни. 18 Ektacytometry исследования ведутся в настоящее время расследовать эту гипотезу (Parrow и Левин, неопубликованные данные). Крови стадии малярийные инфекции является еще один интересный авеню расследований деформируемости эритроцитов. Сотовый деформируемость Plasmodium falciparum инфицированных красных кровяных клеток снижается резко в течение 48 часов внутриклеточных созревания паразита от кольцевой этап Шизонт сцену. Данные свидетельствуют, что это снижение деформируемости восстанавливается после созревания паразита. Реверсирование совпадает с выпуска инфицированных эритроцитов в кровоток. Считается, что снижение деформируемости опосредовано Plasmodium белки, которые способствуют связыванию красных клеток. 19 эти исследования представляют собой небольшой выборки клинически важные условия, где измерения деформируемость эритроцитов и осмотический градиент параметры актуальны. Существует несколько дополнительных областей исследования.
Альтернативные методы для измерения деформируемости эритроцитов включают в себя Оптический пинцет (также известный как лазерные ловушки), которые используют физические свойства фотонов растянуть единый эритроцитов в одном или нескольких направлениях. 20 эта техника имеет преимущество измерения деформируемость эритроцитов одной, но некоторая неопределенность в силу Калибровка производится значительная изменчивость через исследования 21 и анализ данных может быть трудоемкой если автоматизированы. 22 микропипеткой стремление, которое использует отрицательное давление аспирационная эритроцитов в микропипеткой, также используются для измерения деформируемости эритроцитов. 7 , 23 несколько измерений, таких как давление, необходимое для аспирационная эритроцитов, возможны с каждой меры, определяющие различные характеристики эритроцитов. 23 атомно-силовой микроскопии — это метод высоким разрешением, что меры жесткость мембраны количественной лазерного луча прогиб как индикатор отклонения кантилевера вдоль поверхности эритроцитов. 24 эти методы предоставляют информацию об отдельных эритроцитов, легко не приспособлены для измерения изменений в популяциях красных кровяных клеток и, в целом, требуют значительных технических знаний.
Желание попробовать как индивидуальных, так и популяции клеток одновременно привело к достижения в области автоматизации и развитие микрофлюидика и методов на основе массива. Как ektacytometry rheoscopy меры деформируемость как функция касательное напряжение, но образы приобретаются непосредственно через микроскоп. 25 , выше через путь анализа автоматизированных клеток был нанят производить деформируемости распределений, используя rheoscope. 26 сотовой неоднородность может быть определена количественно этот метод если доступны данные от здорового управления субъекта. 27 микрофлюидика методы позволяют также для высокой через положить анализ единичных клеток; несколько образцов, с помощью фильтрации,28 ячеек транзита анализаторы,29 , который измеряет время, необходимое для эритроцитов потока через своих и альтернатив, которые измеряют давление, необходимое для транзита эритроцитов скорее чем время 30 были разработаны. Другую платформу для высокой через положить анализ отдельных клеток является одной ячейки microchamber массив чип, который имеет дополнительное преимущество, позволяя для вниз по течению на основе флуоресценции характеристика клеток. 31 хотя каждый из этих методов является потенциально полезным и может быть лучше для конкретных приложений, сравнительные преимущества ektacytometry включает чувствительность, простоты использования и точности. 32 последнего поколения коммерчески доступных ektacytometers также имеют значительную гибкость в количество анализов, которые могут быть выполнены.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ektacytometry методы, описанные простой и хорошо автоматизированных, обеспечение действительны и воспроизводимые результаты. Тем не менее существуют некоторые важные шаги. Контроль правильной температуры крови имеет важное значение. Хранения при комнатной температуре более восьми часов м?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана интрамуральных исследовательской программы национальных институтов диабета, пищеварительной и заболеваний почек и Национальный сердца, легких и крови института национальных институтов здоровья. Мнения, высказанные здесь, являются предметом ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья.
Materials
| LoRRca MaxSis standard version | Mechatronics | LORC109000 | |
| LoRRca MaxSis Osmoscan | Mechatronics | LORC109001 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm | Mechatronics | QRR030910 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm | Mechatronics | QRR030930 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials | Mechatronics | QRR030901 | |
| X clean | Mechatronics | QRR010946 | |
| P1000 | MilliporeSigma | Z646555 | |
| P200 | MilliporeSigma | Z646547 | |
| P200 filter tips | MidSci | AV200-H | |
| P1250 filter tips | MidSci | AV1250-H | |
| Kimwipes | MidSci | 8091 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| 15 mL conical vial | MidSci | C15R |
Referenzen
- Bessis, M., Mohandas, N., Feo, C. Automated ektacytometry: a new method of measuring red cell deformability and red cell indices. Blood Cells. 6 (3), 315-327 (1980).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Osmotic gradient ektacytometry: comprehensive characterization of red cell volume and surface maintenance. Blood. 61 (5), 899-910 (1983).
- Da Costa, L., et al. Diagnostic tool for red blood cell membrane disorders: Assessment of a new generation ektacytometer. Blood Cells Mol Dis. 56 (1), 9-22 (2016).
- Clark, M. R., Mohandas, N., Shohet, S. B. Deformability of oxygenated irreversibly sickled cells. J Clin Invest. 65 (1), 189-196 (1980).
- Rabai, M., et al. Deformability analysis of sickle blood using ektacytometry. Biorheology. 51 (2-3), 159-170 (2014).
- Bessis, M., Mohandas, N. Laser Diffraction Patterns of Sickle Cells in Fluid Shear Fields. Blood Cells. 3, 229-239 (1977).
- Kim, Y., Kim, K., Park, Y., Moschandreou, T. E. . Blood Cell – An Overview of Studies in Hematology. , (2012).
- Streekstra, G. J., Dobbe, J. G., Hoekstra, A. G. Quantification of the fraction poorly deformable red blood cells using ektacytometry. Opt Express. 18 (13), 14173-14182 (2010).
- Renoux, C., et al. Importance of methodological standardization for the ektacytometric measures of red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (2), 173-179 (2016).
- Parrow, N. L., et al. Measurements of red cell deformability and hydration reflect HbF and HbA2 in blood from patients with sickle cell anemia. Blood Cells Mol Dis. 65, 41-50 (2017).
- Ballas, S. K., Smith, E. D. Red blood cell changes during the evolution of the sickle cell painful crisis. Blood. 79 (8), 2154-2163 (1992).
- Johnson, R. M., Ravindranath, Y. Osmotic scan ektacytometry in clinical diagnosis. J Pediatr Hematol Oncol. 18 (2), 122-129 (1996).
- Mohandas, N., Clark, M. R., Jacobs, M. S., Shohet, S. B. Analysis of factors regulating erythrocyte deformability. J Clin Invest. 66 (3), 563-573 (1980).
- Lazarova, E., Gulbis, B., Oirschot, B. V., van Wijk, R. Next-generation osmotic gradient ektacytometry for the diagnosis of hereditary spherocytosis: interlaboratory method validation and experience. Clin Chem Lab Med. 55 (3), 394-402 (2017).
- Anderson, C., Aronson, I., Jacobs, P. Erythrocyte Deformability is Reduced and Fragility increased by Iron Deficiency. Hematology. 4 (5), 457-460 (1999).
- Reinhart, W. H., et al. Washing stored red blood cells in an albumin solution improves their morphologic and hemorheologic properties. Transfusion. 55 (8), 1872-1881 (2015).
- Shin, S., et al. Progressive impairment of erythrocyte deformability as indicator of microangiopathy in type 2 diabetes mellitus. Clin Hemorheol Microcirc. 36 (3), 253-261 (2007).
- Tu, H., et al. Low Red Blood Cell Vitamin C Concentrations Induce Red Blood Cell Fragility: A Link to Diabetes Via Glucose, Glucose Transporters, and Dehydroascorbic Acid. EBioMedicine. 2 (11), 1735-1750 (2015).
- Tiburcio, M., et al. A switch in infected erythrocyte deformability at the maturation and blood circulation of Plasmodium falciparum transmission stages. Blood. 119 (24), e172-e180 (2012).
- Henon, S., Lenormand, G., Richert, A., Gallet, F. A new determination of the shear modulus of the human erythrocyte membrane using optical tweezers. Biophys J. 76 (2), 1145-1151 (1999).
- Mills, J. P., Qie, L., Dao, M., Lim, C. T., Suresh, S. Nonlinear elastic and viscoelastic deformation of the human red blood cell with optical tweezers. Mech Chem Biosyst. 1 (3), 169-180 (2004).
- Moura, D. S., et al. Automatic real time evaluation of red blood cell elasticity by optical tweezers. Rev Sci Instrum. 86 (5), 053702 (2015).
- Evans, E. A. New membrane concept applied to the analysis of fluid shear- and micropipette-deformed red blood cells. Biophys J. 13 (9), 941-954 (1973).
- Chen, X., Feng, L., Jin, H., Feng, S., Yu, Y. Quantification of the erythrocyte deformability using atomic force microscopy: correlation study of the erythrocyte deformability with atomic force microscopy and hemorheology. Clin Hemorheol Microcirc. 43 (3), 243-251 (2009).
- Musielak, M. Red blood cell-deformability measurement: review of techniques. Clin Hemorheol Microcirc. 42 (1), 47-64 (2009).
- Dobbe, J. G., Streekstra, G. J., Hardeman, M. R., Ince, C., Grimbergen, C. A. Measurement of the distribution of red blood cell deformability using an automated rheoscope. Cytometry. 50 (6), 313-325 (2002).
- Dobbe, J. G., et al. Analyzing red blood cell-deformability distributions. Blood Cells Mol Dis. 28 (3), 373-384 (2002).
- Kikuchi, Y., Arai, T., Koyama, T. Improved filtration method for red cell deformability measurement. Med Biol Eng Comput. 21 (3), 270-276 (1983).
- Moessmer, G., Meiselman, H. J. A new micropore filtration approach to the analysis of white cell rheology. Biorheology. 27 (6), 829-848 (1990).
- Guo, Q., et al. Microfluidic analysis of red blood cell deformability. J Biomech. 47 (8), 1767-1776 (2014).
- Doh, I., Lee, W. C., Cho, Y. H., Pisano, A. P., Kuypers, F. A. Deformation measurement of individual cells in large populations using a single-cell microchamber array chip. Appl Phys Lett. 100 (17), 173702-173703 (2012).
- Baskurt, O. K., et al. Comparison of three commercially available ektacytometers with different shearing geometries. Biorheology. 46 (3), 251-264 (2009).
- Baskurt, O. K., et al. New guidelines for hemorheological laboratory techniques. Clin Hemorheol Microcirc. 42 (2), 75-97 (2009).
- Uyuklu, M., et al. Effects of storage duration and temperature of human blood on red cell deformability and aggregation. Clin Hemorheol Microcirc. 41 (4), 269-278 (2009).
- Uyuklu, M., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effect of hemoglobin oxygenation level on red blood cell deformability and aggregation parameters. Clin Hemorheol Microcirc. 41 (3), 179-188 (2009).
- Embury, S. H., Clark, M. R., Monroy, G., Mohandas, N. Concurrent sickle cell anemia and alpha-thalassemia. Effect on pathological properties of sickle erythrocytes. J Clin Invest. 73 (1), 116-123 (1984).
- von Tempelhoff, G. F., et al. Correlation between blood rheological properties and red blood cell indices(MCH, MCV, MCHC) in healthy women. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (1), 45-54 (2016).
- Da Costa, L., Galimand, J., Fenneteau, O., Mohandas, N. Hereditary spherocytosis, elliptocytosis, and other red cell membrane disorders. Blood Rev. 27 (4), 167-178 (2013).
