Messung der Verformbarkeit und Heterogenität der Erythrozyten im Blut durch Ektacytometry
Summary
Hier stellen wir Ihnen Techniken, um die Verformbarkeit der Erythrozyten und zelluläre Heterogenität von Ektacytometry zu messen. Diese Techniken sind für allgemeine Untersuchungen von Erythrozyten Verformbarkeit und spezifische Untersuchungen von Erkrankungen des Blutes gekennzeichnet durch das Vorhandensein von starren und verformbare Erythrozyten im Umlauf, wie Sichelzellanämie.
Abstract
Verminderten Erythrozyten Verformbarkeit ist charakteristisch für mehrere Erkrankungen. In einigen Fällen kann das Ausmaß der mangelhafte Verformbarkeit Vorhersagen, schwere der Erkrankung oder Auftreten von schwerwiegenden Komplikationen. Ektacytometry nutzt laser Beugung Viscometry um die Verformbarkeit der roten Blutkörperchen unter zunehmender Schubspannung oder einen osmotischen Gradienten auf einem konstanten Wert der angewandten Scherbeanspruchung zu messen. Direkte Verformbarkeit Messungen sind jedoch schwierig zu interpretieren, wenn heterogene Blut zu messen, die durch die Anwesenheit von starren und verformbare roten Blutkörperchen gekennzeichnet ist. Dies ist aufgrund der Unfähigkeit der starren Zellen als Reaktion auf Scherbeanspruchung und Ergebnisse in einem verzerrten Beugungsmuster gekennzeichnet durch eine übertriebene Abnahme der scheinbaren Verformbarkeit richtig ausrichten. Die Messung für den Grad der Verzerrung liefert einen Indikator für die Heterogenität der Erythrozyten im Blut. Sichelzell-Anämie ist dies korreliert mit den Prozentsatz der starren Zellen widerspiegelt die Hämoglobin-Konzentration und Zusammensetzung Hämoglobin der Erythrozyten. Neben der Messung Verformbarkeit, informiert osmotischen Gradienten Ektacytometry über die osmotische Fragilität und Flüssigkeitszufuhr Status der Erythrozyten. Dieser Parameter spiegelt sich auch die Zusammensetzung der Hämoglobin der roten Blutkörperchen von Sichelzelle Patienten. Ektacytometry misst Verformbarkeit in Populationen von Erythrozyten und liefert keine, daher Informationen über die Verformbarkeit oder mechanischen Eigenschaften der einzelnen Erythrozyten. Unabhängig davon ist das Ziel der hier beschriebenen Techniken ermöglichen eine bequeme und zuverlässige Methode zur Messung der Verformbarkeit und zelluläre Heterogenität des Blutes. Diese Techniken können für die Überwachung der zeitlichen Veränderungen und Fortschreiten der Krankheit sowie Reaktion auf therapeutische Intervention in mehreren Erkrankungen nützlich sein. Sichelzellenanämie ist eine gut charakterisierte Beispiel. Andere möglichen Störungen, wo Messungen der Verformbarkeit der Erythrozyten und/oder Heterogenität von Interesse sind, gehören Blut Lagerung, Diabetes, Plasmodium Infektion, Eisenmangel und hämolytische Anämien aufgrund von defekten Membran.
Introduction
Ektacytometry bietet ein bequem Maß für die Verformbarkeit der Erythrozyten als Reaktion auf Veränderungen der Schubspannung (gemessen in Pascal (Pa)) oder mittlere Osmolalität auszusetzen. Relevante Parameter der Verformbarkeit der Erythrozyten enthalten die maximale Dehnung Index (EI-Max), ein Maß für die maximale Verformbarkeit der Erythrozyten als Reaktion auf zunehmende Schubspannung und Schubspannung ½ (SS ½), der Schubspannung erforderlich, um die Hälfte Maximal zu erreichen Verformbarkeit. 1 osmotischen Gradienten Ektacytometry hat mehrere informative Parameter. Dazu gehören die Dehnung Index mindestens (EI Min), ein Maß für die Oberflächen-Volumen-Verhältnis und der Osmolalität, zu dem er auftritt (O Min), das ist ein Maß für die osmotische Fragilität. EI-Max und der Osmolalität, zu der er auftritt (O (EI-Max)) geben Auskunft über Flexibilität und Zelle Membranfläche. Halbe maximale Dehnung im Studienarm mit hypertonen des osmotischen Gradienten wird durch EI hyper dargestellt. EI hyper und der Osmolalität, zu der er auftritt, O hyper, geben Aufschluss über die intrazelluläre Viskosität der roten Zelle bestimmt durch Hämoglobin-Konzentration. 2 , 3 Messung Verformbarkeit im heterogenen Blut wird durch die Tatsache erschwert, die starre Zellen, wie Sichelzellen Erythrozyten nicht richtig mit der Richtung der Strömung wie verformbaren Zellen in Reaktion auf die steigende Schubspannung ausrichten. Anstatt eine charakteristischen elliptischen Beugung Bild, produzieren starre Zellen eine sphärische Muster führt zu einem rautenförmigen Beugungsmuster wenn überlagert auf der Ellipse von verformbaren Zellen produziert. 4 , 5 , 6 das kugelförmige Muster nachweislich irreversibel Sichelzellen Zellen entsprechen, indem die Ektacytometry auf isolierte Bruchteile von Zellen nach Dichte Zentrifugation. 6 die Dehnung Indexberechnung umfasst Maßnahmen der langen und kurzen Achse der Ellipse. eine Rautenform produziert also eine scheinbare Abnahme der Dehnung durch Erhöhung der Breite der kurzen Achse. 7 es hat bisher gezeigt, dass der Grad der Beugung Muster Verzerrung mit der Prozentsatz der Sichel Hämoglobin (HbS) und der Anteil der Sichelzellen Zellen im Blut von Patienten mit Sichelzellenanämie korreliert ist. 5 der Grad der Beugung Muster Verzerrung erhalten Sie durch komplexe mathematische Analysen. 8 es kann auch erreicht werden durch Anpassung der Öffnung der Kamera Blende auf die Ektacytometer oder die graue Ebene der Anpass-Software um die Beugung Muster Höhe ändern. 5 allerdings Einzelheiten darüber, wie man den grauen Pegel sind nicht klar definiert und die Blende der Kamera ist nicht leicht zugänglich auf der neuesten Generation der im Handel erhältlichen Ektacytometer. Um diese Probleme zu umgehen, kann leicht zugängliche Kameraverstärkung zur Beugung Muster Höhen einstellen. 9 mit dieser Methode, um zelluläre Heterogenität zu schätzen, kann der Grad der Beugung Muster Verzerrung mit dem Prozentsatz des fetalen Hämoglobins im Blut von Patienten mit Sichelzellenanämie korreliert werden. 10 verschiedene osmotischen Gradienten Ektacytometry Parameter sind ebenso korreliert mit der Anteil der fetalen oder Sichel Hämoglobin im Blut von Patienten mit Sichelzellenanämie. Beugung Muster Verzerrung Korrelationen wahrscheinlich spiegeln den Beitrag der Hämoglobin-Zusammensetzung auf den Prozentsatz der starren, nicht verformbaren Zellen. Weitere Sehenswürdigkeiten erfährt das gesamte osmotischen Gradienten Ektacytometry Profil biphasische Änderungen, die den Prozentsatz der dichten Zellen im Umlauf während Sichelzelle Krise entsprechen. 11
Ektacytometry ist ebenso nützlich in der Studie von einigen anderen Störungen. Osmotischen Gradienten Ektacytometry ist diagnostisch für geerbte Erythrozyten Membran Erkrankungen, wie z. B. erbliche Spherocytosis, erbliche Elliptocytosis und erbliche Pyropoikilocytosis. 3 , 12 , 13 , 14 erniedrigter Verformbarkeit tritt in einem Eisenmangel. 15 Charakterisierung der “Lagerung Läsion” des Blutes beschäftigt Ektacytometry und Zukunftsforschung untersucht sowohl die Art der Läsion und Interventionen zur Verhinderung der Bildung bei der Lagerung von Blutkonserven werden voraussichtlich in den Genuss der hier vorgestellten Techniken. 16 erniedrigter Erythrozyten Verformbarkeit hat auch mit mikrovaskuläre Erkrankungen bei Diabetes korreliert. 17 Studien Verknüpfung Hyperglykämie, schlage Erythrozyten Ascorbat Konzentrationen und osmotische Fragilität dieser Faktoren in der Entwicklung von mikrovaskuläre Erkrankungen wichtig sein können. 18 Ektacytometry Studien sind derzeit im Gange, diese Hypothese zu untersuchen (Parrow und Levine, unveröffentlichte Daten). Blut-Bühne-Malaria-Infektion ist eine weitere interessante Möglichkeit Erythrozyten Verformbarkeit Untersuchungen. Zelluläre Verformbarkeit von Plasmodium Falciparum infizierten roten Blutkörperchen sinkt drastisch während der 48 Stunden der intrazellulären Reifung des Parasiten von Ring Bühne Schizont Bühne. Deutet darauf hin, dass diese geringere Verformbarkeit bei der Reifung des Parasiten umgekehrt wird. Die Auflösung fällt mit Freisetzung von infizierten Erythrozyten in den Blutkreislauf. Geringere Verformbarkeit wird gedacht, um durch Plasmodium Proteine vermittelt, die Sequestrierung der roten Zelle fördern. 19 diese Studien stellen eine kleine Auswahl von klinisch relevanten Bedingungen wo Mess Verformbarkeit der Erythrozyten und osmotischen Gradienten Parameter relevant sind. Mehrere weitere Studienbereiche vorhanden sein.
Alternative Verfahren zur Messung der Verformbarkeit der Erythrozyten gehören optische Pinzette (auch bekannt als Laser-fallen), die die physikalischen Eigenschaften von Photonen verwenden, um einzelne Erythrozyten in eine oder mehrere Richtungen zu dehnen. 20 diese Technik hat den Vorteil, die Verformbarkeit der einzelnen Erythrozyten zu messen aber einige Unsicherheiten bei der Kraft-Kalibrierung hat beträchtliche Variabilität über Studien 21 produziert und Datenanalyse arbeitsintensiv sein kann, wenn automatisiert. 22 Mikropipette Aspiration, die Unterdruck verwendet, um eine Erythrozyten in einer Mikropipette Aspirieren, wurde auch eingesetzt, um Verformbarkeit der Erythrozyten zu messen. 7 , 23 mehrere Messungen, wie der Druck erforderlich, um die rote Zelle Aspirieren sind möglich mit jeder Maßnahme, die verschiedenen Merkmale der roten Zelle definieren. 23 Rasterkraftmikroskopie ist eine hohe Auflösung-Technik, die Steifigkeit der Membran misst durch Quantifizierung der Laserstrahl Durchbiegung als Indikator der Freischwinger Auslenkung entlang der Oberfläche einer Zelle rot. 24 diese Techniken bieten Informationen über die einzelnen Erythrozyten, sind nicht leicht angepasst, um Veränderungen in Populationen von Erythrozyten zu messen, und im Allgemeinen erfordern erhebliche technische Expertise.
Der Wunsch, individuelle und Populationen von Zellen gleichzeitig probieren hat zu Fortschritten in der Automation und der Entwicklung der Mikrofluidik und Array-basierte Methoden geführt. Wie Ektacytometry Rheoscopy misst Verformbarkeit als Funktion der Schubspannung, sondern Bilder direkt per Mikroskop erworben werden. 25 für höheren Durchsatz Analysen wurde automatisierte Zelle Bildgebung eingesetzt, um Verformbarkeit Verteilungen durch die Rheoscope zu produzieren. 26 zellulären Heterogenität kann mit dieser Methode quantifiziert werden, wenn Daten bei einer gesunden Person zur Verfügung stehen. 27 Mikrofluidik Techniken erlauben auch für hohen Durchsatz Analysen einzelner Zellen; mehrere Designs mit Anpassungen der Filtration,28 Zelle Transit Analysatoren,29 , den Zeitaufwand für eine Erythrozyten-Strömung durch eine Zusammenarbeit misst, und Alternativen, die den Druck für Erythrozyten Transit eher messen als Zeit 30 entstanden sind. Eine weitere Plattform für hohen Durchsatz-Analyse einzelner Zellen ist die einzelne Zelle Microchamber Array Chip, hat den zusätzlichen Vorteil, dass für nachgeschaltete Fluoreszenz basierende Charakterisierung der Zellen. 31 Obwohl jede dieser Techniken ist potenziell nützlich und kann für bestimmte Anwendungen überlegen, die komparativen Vorteile der Ektacytometry umfasst Empfindlichkeit, einfache Handhabung und Präzision. Besitzen Sie 32 die neueste Generation von im Handel erhältlichen Ektacytometers auch große Vielseitigkeit in der Anzahl der Tests, die durchgeführt werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Ektacytometry beschriebenen Techniken sind einfach und gut automatisiert, valide und reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten. Dennoch gibt es einige wichtige Schritte. Richtige Temperaturkontrolle des Blutes ist wichtig. Lagerung bei Raumtemperatur für mehr als acht Stunden beeinträchtigen SS ½ Werte. 34 die Gewährleistung, dass die Temperatur der Maschine stabil bei 37 ° C ist auch wichtig, wie Viskosität des Mediums Aussetzung temperaturabhängig ist. Blut sollte voll Sauerstoff s…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den intramuralen Research Program des National Institute of Diabetes, Magen-Darm und Nieren-Erkrankungen und der National Heart, Lung and Blood Institute der National Institutes of Health unterstützt. Die hier geäußerten Meinungen liegen in der alleinigen Verantwortung der Autoren und repräsentieren nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
Materials
| LoRRca MaxSis standard version | Mechatronics | LORC109000 | |
| LoRRca MaxSis Osmoscan | Mechatronics | LORC109001 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 0mOsm | Mechatronics | QRR030910 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 500mOsm | Mechatronics | QRR030930 | |
| Polyvinylpyrrolidone solution (PVP) 5mL vials | Mechatronics | QRR030901 | |
| X clean | Mechatronics | QRR010946 | |
| P1000 | MilliporeSigma | Z646555 | |
| P200 | MilliporeSigma | Z646547 | |
| P200 filter tips | MidSci | AV200-H | |
| P1250 filter tips | MidSci | AV1250-H | |
| Kimwipes | MidSci | 8091 | |
| 1.5 mL eppendorf tubes | MidSci | AVSS1700 | |
| 15 mL conical vial | MidSci | C15R |
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