بروتوكول بسيط عالي الكفاءة لعزل الجزيرة البنكرياسية عن الفئران
Summary
وصف بروتوكول عزل الجزيرة هذا مسارًا جديدًا لحقن الكولاجين لهضم الأنسجة الخارجية وإجراء تدرج مبسط لتنقية الجزر من الفئران. وهو ينطوي على الهضم الأنزيمي، فصل التدرج / تنقية، ومجموعة انتقاء اليد. يمكن أن ينتج عن العزل الناجح 250-350 جزيرة عالية الجودة وكاملة التشغيل لكل ماوس.
Abstract
جزر البنكرياس، وتسمى أيضا الجزر من Langerhans، هي مجموعة من خلايا الغدد الصماء التي تنتج الهرمونات لتنظيم الجلوكوز وغيرها من الوظائف البيولوجية الهامة. الجزر تتكون في المقام الأول من خمسة أنواع من الخلايا التي تفرز الهرمونات: خلايا α تفرز الجلوكاجون، خلايا بيتا تفرز الأنسولين، خلايا δ تفرز سوماتوستاتين، خلايا تفرز غريلين، وخلايا PP تفرز ببتيد البنكرياس. 60 إلى 80٪ من الخلايا في الجزر هي خلايا بيتا، والتي هي أهم خلية السكان لدراسة إفراز الأنسولين. جزر البنكرياس هي نظام نموذج حاسم لدراسة إفراز الأنسولين في الجسم الحي السابق. الحصول على جزر عالية الجودة هو ذو أهمية كبيرة لبحوث مرض السكري. تتطلب معظم إجراءات عزل الجزيرة صعوبة تقنية في الوصول إلى موقع حقن الكولاجين، وإجراءات الهضم القاسية والمعقدة، وخطوات تنقية التدرج المتعددة الكثافة. تتميز هذه الورقة بطريقة بسيطة عالية الإنتاجية لعزل جزيرة الماوس مع أوصاف مفصلة ومظاهرات واقعية، وتبين الخطوات المحددة التالية: 1) حقن الكولاجين P في أمبولة فاتر، وهي منطقة صغيرة تنضم إلى قناة البنكرياس و القناة الصفراوية المشتركة، 2) الهضم الأنزيمي والفصل الميكانيكي للالبنكرياس exocrine، و 3) خطوة تنقية التدرج واحد. مزايا هذه الطريقة هي حقن إنزيم الجهاز الهضمي باستخدام أمبولة أكثر سهولة من Vater، والهضم أكثر اكتمالا باستخدام مزيج من النهج الأنزيمية والميكانيكية، وأبسط خطوة تنقية التدرج واحد. ينتج هذا البروتوكول ما يقرب من 250-350 جزيرة لكل ماوس; والجزر الصغيرة هي مناسبة لمختلف الدراسات في الجسم الحي السابق. المحاذير المحتملة من هذا الإجراء يحتمل أن تكون مصحوبة بأضرار الجزر بسبب الهضم الأنزيمي و / أو حضانة التدرج لفترات طويلة، وكلها يمكن تجنبها إلى حد كبير عن طريق تبرير الإعلان الدقيق لوقت الحضانة.
Introduction
هناك طريقتان شائعتان في الأدب لعزل الجزيرة البنكرياسية. واحد يتطلب استئصال البنكرياس وتقطيعه إلى قطع صغيرة باستخدام مقص الجراحية، ومن ثمهضمه في محلول الكولاجين 1،2،3. طريقة أخرى أكثر دقة هو استخدام شبكة من القنوات الموجودة في البنكرياس لإدخال إنزيم الجهاز الهضمي. وقد استخدمت المواقع التالية لحقن الإنزيم الهضمي: تقاطع القناة الصفراوية والكيسي، المرارة في القناةالصفراوية المشتركة، أو القناة الصفراوية المشتركة نفسها 1،4،5. ومن المعروف أن الجزر لا توزع بالتساوي في البنكرياس. منطقة الطحال يحتوي على معظم الجزر6. في حين أن الطريقة الثانية باستخدام الطرق التشريحية لتقديم الإنزيمات الهضمية يسمح لضخ أكثر اكتمالا من البنكرياس، بما في ذلك منطقة الطحال، وهذا الإجراء غالبا ما يتطلب لقط أو خياطة أمبولة من Vater التي هي من الناحية الفنية تحديا. من حيث تنقية جزيرة، وقد استخدمت التدرجات كثافة متعددة، فضلا عن مصافي الخلاياوالتراجع المغناطيسي لتنقية الجزر 3،7. استخدام هذه التدرجات يمكن أن تستغرق وقتا طويلا والتدرجات فيكول يمكن أن يؤدي إلى ضرر سام من الجزر8.
ويستند البروتوكول الحالي على الطريقة التي وصفها لي وآخرون7، مع تعديلات إضافية تضاف على أساس تجربة أنفسنا والآخرين1،4. الخطوات الأكثر أهمية من بروتوكولنا هي لقط من القناة الصفراوية المشتركة بالقرب من نهاية الكبد، حقن الكولاجين P عن طريق أمبولة فاتر لهضم الأنسجة exocrine، ومن ثم استخدام حمام الماء تهتز لتسريع الهضم ميكانيكيا1، 4،7. في وقت لاحق، يتم تطبيق حل ‘STOP’ لمنع المزيد من الهضم من الجزر. يستخدم HBSS لغسل ما تبقى من الكولاجين P وSTOP الحل. عندما تم استخدام طريقة فيكول لتنقية الجزر البشرية، أفيد أن العائد هو ضعف الجزر مع قدرة وظيفية أكبر (على سبيل المثال، إفراز الأنسولين) بالمقارنة مع استخدام التدرجات Percoll9. ومع ذلك، شككت الدراسات في استخدام تدرج فيكول بسبب تأثيره السام على الجزر1،10. وقد أفيد أن التدرج Histopaque يوفر حركية تنقية الأمثل لعزل جزيرة الماوس، والتي تنتج غلةجيدة من الجزر عالية الجودة مع خطوات أبسط وتكلفة أقل 1. في بروتوكولنا، يستخدم Histopaque-1077 لتنقية الجزرمن الأنسجة المتبقية الأخرى 8،11. يمكن زراعة الجزر المقطوعة في وسائل الإعلام الكاملة RPMI-1640، أو استخدامها مباشرة في RNA /البروتين الكم.
بروتوكولنا، وذلك باستخدام مزيج من الكولاجين P الهضم وخطوة تنقية التدرج واحد، هو أبسط من البروتوكولات المنشورة الأخرى. أسلوبنا لا يتطلب إجراءات جراحية صعبة ولها فقط بضع خطوات بسيطة. والأهم من ذلك، هذا البروتوكول تنتج باستمرار عائد جيد من الجزر الوظيفية عالية الجودة (250-350/mouse) كما أبلغنا12.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويشمل هذا البروتوكول التسريب الكولاجينوووووووالهضم، تليها تنقية الجزر. الخطوات الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هي الحقن الفعال والتسريب الكامل من البنكرياس1،4،7. طريقة التسليم من هذا البروتوكول يسمح للإنزيم لاجتياز الطرق التشريحية لهضم…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للغاية للسيدة جنيفر مونغيا على توضيحها الفني للرسم التخطيطي. نشكر السيد مايكل ر. هونيغ في محطة الإذاعة العامة المجتمعية في هيوستن KPFT على مساعدته التحريرية. تم دعم هذه الدراسة من قبل الجمعية الأمريكية للسكري #1-15-BS-177 (YS)، وNIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). كما تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للأغذية والزراعة التابع لوزارة الزراعة الأمريكية، ومشروع هاتش 1010840 (YS) وR01 DK095118 (SG).
Materials
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P – this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube – swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
Referenzen
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- O’Dowd, J. F. The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans. Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).
- Wang, X. Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas – Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes. PLOS ONE. 8, (2013).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).
- Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients. Surgery. 107 (5), e50374 (1987).
- Salvalaggio, P. R. Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function. Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).
- Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans. Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).
- Pradhan, G., et al. Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R. Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).
- Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion–a comparison with standard technique. Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).
