마우스에서 췌장 췌도 격리를 위한 간단한 고효율 프로토콜
Summary
이 섬 격리 프로토콜은 외분비 조직을 소화하기 위해 콜라게나아제 주사의 새로운 경로를 설명하고 마우스로부터 섬을 정화하기 위한 단순화된 그라데이션 절차를 설명했다. 효소 소화, 그라데이션 분리/정제, 그리고 아일렛 수작업 피킹이 포함됩니다. 성공적인 절연은 마우스당 250~350개의 고품질 및 완전한 기능을 갖춘 아일렛을 생성할 수 있습니다.
Abstract
Langerhans의 섬이라고도 하는 췌장 섬은 포도당 조절 및 기타 중요한 생물학적 기능에 대한 호르몬을 생산하는 내분비 세포의 클러스터입니다. 이 섬은 주로 5가지 유형의 호르몬 분비 세포로 구성됩니다: α 세포는 글루카곤을 분비하고, β 세포는 인슐린을 분비하고, δ 세포는 소마토스타틴을 분비하며, δ 세포는 그렐린을 분비하고, PP 세포는 췌장 폴리펩티드를 분비합니다. 작은 섬에 있는 세포의 60-80%는 인슐린 분비를 공부하는 가장 중요한 세포 인구인 β 세포입니다. 췌도는 생체 내 인슐린 분비를 연구하는 중요한 모델 시스템입니다. 고품질 섬을 확보하는 것은 당뇨병 연구에 매우 중요합니다. 대부분의 아일렛 격리 절차는 콜라게나아제 주입, 가혹하고 복잡한 소화 절차 및 다중 밀도 구배 정제 단계의 부위에 기술적으로 접근하기 어렵습니다. 이 논문은 상세한 설명과 현실적인 데모와 간단한 고수율 마우스 섬 격리 방법을 갖추고 있습니다, 다음과 같은 특정 단계를 보여주는: 1) Vater의 암풀라에서 콜라게나제 P의 주입, 췌장 덕트를 결합하는 작은 영역과 일반적인 담관, 2) 효소 소화 및 외분비 췌장의 기계적 분리, 및 3) 단일 그라데이션 정제 단계. 이 방법의 장점은 Vater의 접근성이 좋은 암풀라를 사용하여 소화 효소를 주입하고 효소 및 기계적 접근법을 사용하여 보다 완전한 소화를 하고, 더 간단한 단일 그라데이션 정제 단계입니다. 이 프로토콜은 마우스당 약 250-350개의 섬을 생성합니다. 및 섬은 다양한 생체 내 연구에 적합하다. 이 절차의 가능한 주의 사항은 효소 소화 및 / 또는 장기간 그라데이션 배양으로 인해 잠재적으로 손상된 섬이며, 이 모든 것은 인큐베이션 시간의 신중한 광고 정당화에 의해 크게 피할 수 있습니다.
Introduction
췌도 격리에 대한 문헌에는 두 가지 일반적인 방법이 있습니다. 하나는 췌장을 절제하고 수술 가위를 사용하여 작은 조각으로 다이싱 한 다음 콜라게 나아제 용액1,2,3으로소화해야합니다. 또 다른 더 정확한 방법은 소화 효소를 소개하기 위하여 췌장에 존재하는 덕트의 네트워크를 이용하는 것입니다. 다음 사이트는 소화 효소 주입에 사용되었습니다 : 담즙 과 낭포 덕트의 접합, 일반적인 담관으로 담낭,또는 일반적인 담관 자체 1,4,5. 작은 섬이 췌장에 고르게 분포되지 않은 것으로 알려져 있습니다. 비장 영역은 가장 작은섬 6을 포함합니다. 소화 효소를 전달하기 위해 해부학 경로를 사용하는 두 번째 방법은 비장 영역을 포함하여 췌장의 보다 완전한 관류를 허용하지만,이 절차는 종종 기술적으로 Vater의 암풀라의 클램핑 또는 봉합이 필요합니다. 도전. 섬 정화의 관점에서, 다중 밀도 그라데이션뿐만 아니라 세포 스트레이너 및 자기 후퇴는 섬을정화하기 위해 사용되어 왔다 3,7. 이러한 그라데이션의 활용은 시간이 많이 소요될 수 있으며 Ficoll 그라데이션은 섬8의독성 손상을 초래할 수 있습니다.
현재 프로토콜은 Li et al. 7에의해 설명된 방법에 기초하여 구축되며, 우리 자신과 다른 사람의 경험을 기반으로 추가 된 수정사항1,4. 우리의 프로토콜의 가장 중요한 단계는 간 끝 의 가까이에 일반적인 담관의 클램핑, 외분비 조직을 소화하기 위하여 Vater의 ampulla를 통해 콜라게나제 P를 주입하고, 그 때 기계적으로 소화를 가속화하기 위하여 동요하는 근해를 사용하여1, 4,7. 이어서, ‘STOP’ 용액이 인가되어 작은 섬들의 추가 소화를 억제한다; HBSS는 나머지 콜라게나제 P 및 STOP 용액을 세척하는 데 사용됩니다. 피콜 방법이 인간 섬을 정화하는 데 사용되었을 때, 수율은 Percoll 그라데이션 9의 사용에 비해 더 큰 기능적 능력(예를 들어,인슐린 분비)을 가진 섬보다 두 배 인 것으로 보고되었다. 그러나, 연구는섬1,10에그것의 독성 효과 때문에 Ficoll 그라데이션의 사용에 의문을 제기 했다 . 히스타크 그라데이션은 마우스 섬 격리를 위한 최적의 정제 역학을 제공하는 것으로 보고되었으며, 이는 더 간단한 단계와 낮은비용으로 고품질 의 섬들의 좋은 수율을 생성한다 1. 우리의 프로토콜에서, Histopaque-1077다른 잔류 조직에서 섬을 정화하는 데사용된다 8,11. 수확된 섬은 완전한 RPMI-1640 배지에서 배양되거나 RNA/단백질 정량에 직접 활용될 수 있다.
콜라게나아제 P 소화와 단일 그라데이션 정제 단계의 조합을 사용하는 당사의 프로토콜은 다른 출판된 프로토콜보다 간단합니다. 우리의 방법은 까다로운 외과 적 수술을 필요로하지 않으며 몇 가지 간단한 단계가 있습니다. 더 중요한 것은, 이 프로토콜은 지속적으로 우리가보고 한바와 같이 고품질 기능 섬 (250-350 / 마우스)의 좋은 수율을 생산하고 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에는 콜라게나아제 관류와 소화가 포함되며, 그 다음에는 섬의 정화가 뒤따릅니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 췌장 1,4,7의효과적인 주입 및 완전한 관류입니다. 이 프로토콜의 전달 방법은 효소가 아일렛 1을 둘러싼 외분비 조직을 더잘 소화하기 위해 해부학 적 경로를 통과하는 것을 허?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 회로도의 그녀의 예술적 그림에 대한 제니퍼 Munguia 씨에게 매우 감사드립니다. 휴스턴의 지역 공영 라디오 방송국 KPFT의 마이클 R. 호니그(Michael R. Honig) 씨에게 편집 지원을 부탁드립니다. 이 연구는 미국 당뇨병 협회 #1-15-BS-177 (YS) 및 NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS)에 의해 지원되었습니다. 이 작품은 또한 USDA 국립 식량 농업 연구소, 해치 프로젝트 1010840 (YS) 및 R01 DK095118 (SG)에 의해 지원되었다.
Materials
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P – this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube – swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
Referenzen
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- O’Dowd, J. F. The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans. Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).
- Wang, X. Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas – Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes. PLOS ONE. 8, (2013).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).
- Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients. Surgery. 107 (5), e50374 (1987).
- Salvalaggio, P. R. Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function. Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).
- Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans. Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).
- Pradhan, G., et al. Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R. Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).
- Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion–a comparison with standard technique. Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).
