Простой протокол высокой эффективности для изоляции поджелудочной железы от мышей
Summary
Этот протокол изоляции островка описал новый маршрут инъекции коллагеназы для переваривания экзокринной ткани и упрощенную процедуру градиента для очищения островков от мышей. Она включает в себя ферментативное пищеварение, градиент разделения / очистки, и на кашет ручной сбор. Успешная изоляция может дать 250-350 высококачественных и полностью функциональных островков на мышь.
Abstract
Островки поджелудочной железы, также называемые островками Лангерганс, представляют собой кластер эндокринных клеток, который производит гормоны для регулирования глюкозы и других важных биологических функций. Островки в основном состоят из пяти типов гормоноскрытяющих клеток: «клетки выделяют глюкагон, клетки выделяют инсулин, клетки выделяют соматостатин, клетки выделяют грелин, а PP-клетки выделяют полипептид поджелудочной железы. Шестьдесят до 80% клеток в островках являются клетками, которые являются наиболее важной популяцией клеток для изучения секреции инсулина. Островки поджелудочной железы являются важнейшей модельной системой для изучения секреции инсулина ex vivo. Приобретение высококачественных островков имеет большое значение для исследования диабета. Большинство процедур изоляции газа требуют технически трудно получить доступ к месту инъекции коллагеназа, суровые и сложные процедуры пищеварения, и несколько шагов градиента плотности. Эта статья имеет простой метод изоляции высокой урожайности мыши с подробным описанием и реалистичными демонстрациями, показывая следующие конкретные шаги: 1) инъекция коллагеназа P на ампуле Vater, небольшой площади присоединения поджелудочной железы и общий желчный проток, 2) ферментативное пищеварение и механическое разделение экзокринной поджелудочной железы, и 3) один шаг очистки градиента. Преимуществами этого метода являются инъекция пищеварительного фермента с использованием более доступной ампулы Vater, более полное пищеварение с использованием сочетания ферментативных и механических подходов, а также более простой шаг очистки градиента. Этот протокол производит примерно 250-350 островков на мышь; и островки подходят для различных исследований ex vivo. Возможными предостережениями этой процедуры являются потенциально поврежденные островки из-за ферментативного пищеварения и/или длительного градиентного инкубации, все из которых можно в значительной степени избежать путем тщательного обоснования инкубационного времени.
Introduction
Есть два распространенных метода в литературе для изоляции поджелудочной железы, атакжем. Один требует иссечения поджелудочной железы и dicinging его на мелкие кусочки с помощью хирургических ножниц, а затем переваривание его в растворколленаза1,2,3. Другой более точный метод заключается в использовании сети протоков, присутствующих в поджелудочной железе, чтобы ввести пищеварительный фермент. Следующие участки были использованы для инъекции пищеварительного фермента: соединение желчного и кистозного протока, желчного пузыря в общий желчный проток, или общий желчный проток сам1,4,5. Известно, что островки не равномерно распределены в поджелудочной железе; селезенки содержит большинство островков6. В то время как второй метод с использованием анатомических путей для доставки пищеварительных ферментов позволяет более полное perfusion поджелудочной железы, в том числе селезенки области, эта процедура часто требует зажима или зашивания ампулы Vater, что технически Сложной. С точки зрения очистки островка, градиенты множественной плотности, а также ситектов и магнитного опрокидки были использованы для очистки островков3,7. Использование этих градиентов может занять много времени, и градиенты Ficollмогут привести к токсическим повреждениям островков 8.
Текущий протокол построен на методе, описанном Li et al.7, с дополнительными изменениями, добавленными на основе опыта себя и других1,4. Наиболее важными шагами нашего протокола являются зажим общего желчного протока вблизи конца печени, инъекционные коллагеназа P через ампулу Ватера, чтобы переварить экзокринную ткань, а затем с помощью трясущейся водяной ванны для ускорения пищеварения механически1, 4,7. Впоследствии, ‘STOP’ решение применяется для ингибирования дальнейшего пищеварения островков; HBSS используется для смывания оставшегося коллагеназа P и STOP раствора. Когда метод Ficoll был использован для очистки человеческих островков, выход, как сообщается, в два раза островки с большей функциональной способностью (например, секреция инсулина) по сравнению с использованием градиентов Percoll9. Тем не менее, исследования поставили под сомнение использование градиента Ficoll из-за его токсического воздействия на островки1,10. Было сообщено, что градиент Histopaque обеспечивает оптимальную очистку кинетики для изоляции островка мыши, который производит хороший выход высококачественных островков с более простыми шагами и более низкой стоимостью1. В нашем протоколе, Histopaque-1077 используется для очистки островков от других остаточных тканей8,11. Собранные островки могут быть культивированы в полном носителе RPMI-1640 или непосредственно использованы в Квантину РНК/белка.
Наш протокол, использующий комбинацию коллагеназа P пищеварения и один шаг очистки градиента, проще, чем другие опубликованные протоколы. Наш метод не требует сложных хирургических процедур и имеет всего несколько простых шагов. Что еще более важно, этот протокол последовательно производит хороший выход высокого качества функциональных островков (250-350/мышь), как мы сообщали12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол включает в себя коллагенеза перфузии и пищеварения, а затем очищение островков. Наиболее важными шагами этого протокола являются эффективнаяинъекция и полная перфузия поджелудочной железы 1,4,7. Метод доставки этого прот?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы чрезвычайно признательны г-же Дженнифер Мунгиа за ее художественную иллюстрацию схематической диаграммы. Мы благодарим г-на Майкла Р. Хонига в Хьюстоне общественной радиостанции KPFT за его редакционную помощь. Это исследование было поддержано Американской диабетической ассоциацией #1-15-BS-177 (YS) и NIH R56DK118334/R01DK18334 (YS). Эта работа была также поддержана Национальным институтом продовольствия и сельского хозяйства Министерства сельского хозяйства США, Hatch проекта 1010840 (YS) и R01 DK095118 (SG).
Materials
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P – this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube – swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
Referenzen
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- O’Dowd, J. F. The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans. Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).
- Wang, X. Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas – Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes. PLOS ONE. 8, (2013).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).
- Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients. Surgery. 107 (5), e50374 (1987).
- Salvalaggio, P. R. Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function. Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).
- Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans. Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).
- Pradhan, G., et al. Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R. Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).
- Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion–a comparison with standard technique. Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).
