מגנטי תא לפעיל על-מיון אסטרטגיות כדי לבודד ולטהר Synovial נגזר הנוזלים בתאי גזע Mesenchymal ממודל ארנב
Summary
מאמר זה מציג פרוטוקול כלכלי ופשוט עבור בידוד ישיר וטיהור של גזע mesenchymal של ניו זילנד הארנב הלבן synovial נוזל.
Abstract
גזע mesenchymal (MSCs) הם המקור העיקרי תא לטיפול מבוססת-תא. MSCs מן נוזל במפרק synovial יכול לשמש באופן פוטנציאלי הנדסת רקמות הסחוס. MSCs מ synovial נוזל (SF-MSCs) היה נחשב מבטיח מועמדים התחדשות מפרקיות, התועלת הטיפולית הפוטנציאלית שלהם גרמה להם נושא מחקר חשוב של המנוח. SF-MSCs מ חלל הברך של הארנב ניו זילנד הלבן יכול להיות מועסק כמודל translational ממוטבת כדי להעריך רפואה רגנרטיבית אנושי. באמצעות מבוססי CD90 מגנטי הופעל תא מיון טכנולוגיות (מקינטוש), פרוטוקול זה בהצלחה משיג ארנב SF-MSCs (rbSF-MSCs) ממודל זה ארנב ועל בהמשך מדגים באופן מלא על פנוטיפ MSC של תאים אלה על ידי גרימת אותם כדי להבדיל את תאי העצם, adipocytes ו- chondrocytes. לכן, ניתן ליישם גישה זו מחקר ביולוגיה של התא, הנדסת רקמות בעזרת ציוד פשוט ונהלים.
Introduction
MSCs שהוצעו מקור רב ערך עבור רפואה רגנרטיבית, במיוחד עבור סחוס נגעים. MSCs, כולל chondrocytes, תאי העצם, adipocytes, השלד של תאי שריר, תאי סטרומה מהבטן, בהרחבה להרחיב את אזורי עבור השתלת תא גזע עקב שלהם הרחבה גבוהה קצב ואת שושלת היוחסין מרובה בידול פוטנציאליים1. MSCs ניתן לבודד השלד שריר, synovium, מח עצם, רקמת שומן2,3,4. הממצאים יש גם confirmed את הנוכחות של MSCs בנוזל synovial, מחקרים קודמים זיהתה MSCs נגזר נוזל synovial (SF-MSCs) מבטיח מועמדים התחדשות מפרקיות5,6.
עם זאת, מחקר וניסוי פרה על דגימות האנושי כפופים סוגיות אתיות רבות. במקום זאת, ארנבים, ממשיכים להיות הכי נפוץ מיני בעלי חיים כדי להדגים כי השתלת של MSCs ניתן לתקן נזק לסחוס. בשנים האחרונות, מספר גדל והולך של חוקרים חקרו ארנב בתאי גזע mesenchymal (rbMSCs) בשני במבחנה , ויוו, כמו תאים אלה הם MSCs דומה האדם בפיזיולוגיה ביולוגיה ורקמות הסלולר שלהם. באופן דומה, rbMSCs מסוגלים הקפדה על משטחי פלסטיק, הצגת ציר-פיברובלסט מורפולוגיה כמו MSCs אנושי. יתרה מזו, דגימות mesenchymal הארנב הם פשוט וקל לקבל7. בנוסף, הנקודות המכריעים הם rbMSCs אקספרס סמני פני השטח, כגון CD44, CD90, CD105, ו הבידול השושלת מרובה פוטנציאליים נשמר, שהוא מסכים עם הקריטריונים לזיהוי של אוכלוסיות MSC כמו מוגדרת על ידי האגודה הבינלאומית הסלולר8,9. בפרט, chondroprogenitors נוזלים synovial מסוגלים chondrogenesis שאינם היפרטרופית כאשר שנגזרות TGF-β1, ובכך הופך אותם מקורות תא מתאים עבור10,התחדשות הסחוס במפרק phenotypically11, 12.
עם זאת, בידודו של SF-MSCs שונה במידה רבה רקמות אחרות, כולל את חבל הטבור, רקמת שומן, דם היקפיים ו מח עצם. כיום, הגישות הנפוצות הטיהור ומיון של SF-MSCs הם cytometry זרימה ומיון immunomagnetic מבוסס-חרוז, למרות השיטה cytometry זרימה דורש סביבה ספציפיים עם מכשירים יקרים מאוד13.
מאמר זה מציג שגרה עבור האוסף פשוטה ולא פולשנית של דוגמיות של נוזל synovial מניו זילנד וארנבים לבנים. במהלך ההליך, rbSF-MSCs stably המורחב במבחנה , ואז מבודדים CD90 נהלים חיובי מבוסס-חרוז מגנטי. לבסוף, הפרוטוקול מראה כיצד להשיג MSCs עם טוהר גבוהה, הכדאיות מן המקורות תא שנקטפו.
ב פרוטוקול זה, מבודד rbSF-MSCs מאופיינים בהתבסס על המורפולוגיה שלהם, ביטוי של סמנים ספציפי, pluripotency של תאי גזע. Immunophenotyping מבוססי cytometry זרימה מגלה ביטוי חיובי משמעותי של CD44 ו- CD105, ואילו הביטוי של CD45 ו- CD34 הוא שלילי. לבסוף, וזמינותו במבחנה עבור rbSF-MSCs מדגים את הבידול osteogenic, adipogenic ו- chondrogenic של תאים אלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
קיומו של MSCs בנוזל synovial מספק אלטרנטיבה לטיפול מבוססת-תא. מחקרים קודמים הראו כי פגיעה האתרים מכילים כמויות גבוהות של גזע mesenchymal בנוזל synovial שלהם, אשר עשוי להיות בקורלציה עם התקופה לאחר פציעה5. MSCs בנוזל synovial עשוי להיות מועיל לרקמות לשיפור ריפוי ספונטני לאחר18,פגי…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מבחינה כלכלית נתמך על ידי המענקים הבאים: יסודות מדעי הטבע של סין (מס 81572198; מס ‘ 81772394); הקרן לבנייה מלימודי הרפואה ברמה גבוהה של שנז’ן יוניברסיטי (מספר 2016031638); קרן המחקר הרפואי של בפרובינצית גואנג-דונג, סין (מס ‘ A2016314); שנג’ן המדע ואת הטכנולוגיה פרויקטים (מס ‘ JCYJ20170306092215436; לא. JCYJ20170412150609690; לא. JCYJ20170413161800287; לא. SGLH20161209105517753; לא. JCYJ20160301111338144).
Materials
| Reagents | |||
| MesenGro | StemRD | MGro-500 1703 | Warm in 37 °C water bath before use |
| MesenGro Supplement | StemRD | MGro-500 M1512 | Component of MSCs culture medium |
| DMEM basic | Gibco Inc. | C11995500BT | MSCs differentiation medium |
| Isotonic saline solution | Litai, China | 5217080305 | Cavity arthrocentesis procedure reagent |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Inc. | 10099-141 | Component of MSCs culture medium |
| Povidone iodine solution | Guangdong, China | 150605 | Sterilization agent |
| 75% ethanol | Lircon, china | 170917 | Sterilization agent |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | Cell dissociation reagent |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | Component of MSCs medium |
| MACS Running Buffer | MiltenyiBiotec | 5160112089 | Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA |
| CD90 antibody conjugated MicroBeads | MiltenyiBiotec | 5160801456 | For magnetic activated cell sorting |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
| ITS | BD | 354352 | 1%, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P5607 | 0.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | 50 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | 0.5 mM, Component of adipogenic differentiation |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 mM, Component of adipogenic differentiation |
| TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| α-glycerophsphate | Sigma-Aldrich | G6751 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
| CD34 Polyclonal Antibody, FITC Conjugated | Bioss | bs-0646R-FITC | Hematopoietic stem cells marker |
| Mouse antirabbit CD44 | Bio-Rad | MCA806GA | Thy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker) |
| CD45 (Monoclonal Antibody) | Bio-Rad | MCA808GA | Hematopoietic stem cells marker |
| CD105 antibody | Genetex | GTX11415 | MSCs marker |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030 | Precipitates RNA extraction organic phases |
| Trichloromethane | Wenge, China | 61553 | Extract total RNA |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | Isolate total RNA |
| SYBR green master mix | Takara Bio, Japan | RR420A | PCR test |
| cDNA synthesis kit | Takara Bio, Japan | RR047A | Reverse-transcribed to complementary DNA |
| Alizarin Red | Sigma-Aldrich | A5533 | Staining of calcium compounds |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | Staining of cartilaginous tissue |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1391L | Lipid vacuole staining |
| Equipment | |||
| MiniMACS Separator | MiltenyiBiotec | 130-042-102 | For magnetic activated cell sorting |
| MultiStand | MiltenyiBiotec | 130-042-303 | For magnetic activated cell sorting |
| MS Columns | MiltenyiBiotec | 130-042-201 | For magnetic activated cell sorting |
| Cell Strainer | FALCON Inc. | 352340 | 40 μm nylon |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | Cell counting |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | Cell culture dish |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | RNA Extraction and PCR |
| Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | Centrifuge cells |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | Cell culture |
| Real-Time PCR Instrument | Life Tech | QuantStudio | Real-Time quantitative polymerase chain reaction |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 342975 | Cell analyzer |
| Pipettor | Eppendorf | O25456F | Transfer the liquid |
| Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | Isolate and pick individual cell colonies |
| Sterile hypodermic syringe | Double-Dove, China | 131010 | Arthrocentesis procedure |
| Rabbit cage | Zhike, China | ZC-TGD | Restrain the rabbit |
Referenzen
- Oreffo, R. O., Cooper, C., Mason, C., Clements, M. Mesenchymal stem cells: lineage, plasticity, and skeletal therapeutic potential. Stem Cell Reviews. 1 (2), 169-178 (2005).
- Asakura, A., Rudnicki, M. A., Komaki, M. Muscle satellite cells are multipotential stem cells that exhibit myogenic, osteogenic, and adipogenic differentiation. Differentiation. 68 (4-5), 245-253 (2001).
- De, B. C., Dell’Accio, F., Tylzanowski, P., Luyten, F. P. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane. Arthritis Rheumatology. 44 (8), 1928-1942 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- McGonagle, D., Jones, E., English, A., Emery, P. Enumeration and phenotypic characterization of synovial fluid multipotential mesenchymal progenitor cells in inflammatory and degenerative arthritis. Arthritis & Rheumatism. 50 (3), 817-827 (2004).
- Jia, Z., et al. Isolation and characterisation of human mesenchymal stem cells derived from synovial fluid by magnetic activated cell sorting (MACS). Cell Biology International. , (2017).
- Bashir, M., et al. Isolation, culture and characterization of New Zealand white rabbit mesenchymal stem cells derived from bone marrow. Asian Journal of Animal & Veterinary Advances. 10 (8), 13-30 (2015).
- Song, X., et al. Differentiation potential of rabbit CD90-positive cells sorted from adipose-derived stem cells in vitro. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 53 (1), 1-6 (2016).
- Lee, T. C., et al. Comparison of surface markers between human and rabbit mesenchymal stem cells. PLOS One. 9 (11), e111390 (2014).
- Stewart, M. C., Chen, Y., Bianchessi, M., Pondenis, H. Phenotypic characterization of equine synovial fluid-derived chondroprogenitor cells. Stem Cell Biology and Research. 3 (1), (2016).
- Prado, A. A. F., et al. Characterization of mesenchymal stem cells derived from the equine synovial fluid and membrane. BioMed Central Veterinary Research. 11 (1), 281 (2015).
- Yoshimura, H., et al. Comparison of rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow, synovium, periosteum, adipose tissue, and muscle. Cell and Tissue Research. 327 (3), 449-462 (2007).
- Wu, C. C., et al. Intra-articular injection of platelet-rich fibrin releasates in combination with bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of articular cartilage defects: an in vivo study in rabbits. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (6), 1536-1543 (2017).
- John, T., Lerche, P. . Anesthesia and Analgesia for Veterinary Technicians. , (2011).
- Koyama, N., et al. Pluripotency of mesenchymal cells derived from synovial fluid in patients with temporomandibular joint disorder. Life Sciences. 89 (19-20), 741-747 (2011).
- Kim, Y. S., et al. Isolation and characterization of human mesenchymal stem cells derived from synovial fluid in patients with osteochondral lesion of the talus. American Journal of Sports Medicine. 43 (2), 399-406 (2015).
- Vereb, Z., et al. Immunological properties of synovial fluid-derived mesenchymal stem cell-like cells in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 74 (Suppl 1), A64-A65 (2015).
- Matsukura, Y., Muneta, T., Tsuji, K., Koga, H., Sekija, I. Mesenchymal stem cells in synovial fluid increase after meniscus injury. Clinical Orthopaedics & Related Research. 472 (5), 1357-1364 (2014).
- Morito, T., et al. Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans. Rheumatology. 47 (8), 1137-1143 (2008).
- Hegewald, A. A., et al. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue & Cell. 36 (6), 431-438 (2004).
- Jones, E. A., et al. Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: detection and functional evaluation at the single cell level. Arthritis & Rheumatism. 58 (6), 1731-1740 (2008).
- Makker, K., Agarwal, A., Sharma, R. K. Magnetic activated cell sorting (MACS): utility in assisted reproduction. Indian Journal of Experimental Biology. 46 (7), 491-497 (2008).
- Schmitz, B., et al. Magnetic activated cell sorting (MACS) — a new immunomagnetic method for megakaryocytic cell isolation: comparison of different separation techniques. European Journal of Haematology. 52 (5), 267-275 (1994).
- Reinhardt, M., Bader, A., Giri, S. Devices for stem cell isolation and delivery: current need for drug discovery and cell therapy. Expert Review of Medical Devices. 12 (3), 353-364 (2015).
- Gronthos, S., Zannettino, A. C. W., Prockop, D. J., Bunnell, B. A., Phinney, D. G. A method to isolate and purify human bone marrow stromal stem cells. Mesenchymal Stem Cells. , 45-57 (2008).
- Krawetz, R. J., et al. Synovial fluid progenitors expressing CD90+ from normal but not osteoarthritic joints undergo chondrogenic differentiation without micro-mass culture. PLOS One. 7 (8), e43616 (2012).
- Ogata, Y., et al. Purified human synovium mesenchymal stem cells as a good resource for cartilage regeneration. PLOS One. 10 (6), e0129096 (2015).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells: the International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Gauci, S. J., et al. Modulating chondrocyte hypertrophy in growth plate and osteoarthritic cartilage. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interact. 8 (4), 308 (2008).
- Cooke, M. E., et al. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with chondrocytes promotes chondrogenic differentiation without hypertrophy. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (10), 1210-1218 (2011).
- Fischer, J., Dickhut, A., Rickert, M., Richter, W. Human articular chondrocytes secrete parathyroid hormone-related protein and inhibit hypertrophy of mesenchymal stem cells in coculture during chondrogenesis. Arthritis and Rheumatism. 62 (9), 2696-2706 (2010).
