Célula activada por el magnético clasificación estrategias para aislar y purificar sinovial líquido mesenquimales células madre derivadas de un modelo de conejo
Summary
Este artículo presenta un protocolo sencillo y económico para el simple aislamiento y purificación de células madre mesenquimales del líquido sinovial del conejo blanco de Nueva Zelanda.
Abstract
Las células madre mesenquimales (MSCs) son la fuente principal de la célula para terapia basada en células. Pueden utilizar MSCs de líquido sinovial de la cavidad articular para la ingeniería del tejido fino del cartílago. MSCs de líquido sinovial (SF-MSCs) han sido considerados candidatos prometedores para la regeneración articular, y su potencial beneficio terapéutico les ha hecho un tema de investigación importante últimamente. SF-MSCs de la cavidad de la rodilla del conejo Nueva Zelanda blanco pueden ser empleados como modelo traduccional optimizado para evaluar humana medicina regenerativa. Por medio de CD90-basado celular activado magnética clasificación tecnologías (MACS), este protocolo con éxito obtiene conejo SF-MSCs (rbSF-MSCs) de este modelo de conejo y completamente demuestra el fenotipo MSC de estas células induciendo a distinguir a osteoblastos, adipocitos y condrocitos. Por lo tanto, este enfoque puede aplicarse en la investigación en biología celular e Ingeniería del tejido fino usando procedimientos y equipos sencillos.
Introduction
MSCs se han sugerido como una fuente valiosa para la medicina regenerativa, especialmente para las lesiones de cartílago. MSCs, incluyendo condrocitos, osteoblastos, adipocitos, miocitos esqueléticos y viscerales células stromal, ampliamente amplían las áreas para el trasplante de células madre debido a su alta expansión tasa y multilineal diferenciación potencial1. MSCs pueden ser aislados de los esquelético muscular, membrana sinovial, la médula ósea y tejido adiposo2,3,4. Resultados tienen también confirmó la presencia de MSCs en el líquido sinovial, y la investigación anterior ha identificado MSCs derivados del líquido sinoviales (SF-MSCs) como candidatos prometedores para la regeneración articular5,6.
Sin embargo, investigación y experimentación preclínica en muestras humanas están sujetas a muchas cuestiones éticas. En cambio, conejos han sido y siguen siendo los más utilizados las especies animales para demostrar que el trasplante de MSCs puede reparar el daño de cartílago. En los últimos años un número creciente de investigadores ha estudiado las células madre mesenquimales conejo (rbMSCs) ambos en vitro y en vivo, como estas células son MSCs similares al ser humano en su fisiología celular biología y tejido. Asimismo, los rbMSCs son capaces de adherirse a las superficies plásticas, mostrando morfología de fibroblastos fusiformes en MSCs humanos. Además, las muestras mesenquimales conejo son simples y fáciles de obtener7. Además, los puntos más importantes son que rbMSCs expresan marcadores de superficie, como el CD44, CD90, CD105, y que se conserva la diferenciación multilineal potencial, que está de acuerdo con los criterios para la identificación de las poblaciones de MSC como definido por la sociedad internacional de terapia celular8,9. En particular, son capaces de condrogénesis no hipertrófica cuando inducida por TGF-β1, así haciéndolos fuentes celular adecuado para el cartílago articular fenotípicamente regeneración10,11, chondroprogenitors líquidos sinoviales 12.
Sin embargo, el aislamiento de SF-MSCs es mucho diferente de otros tejidos, incluyendo el cordón umbilical, tejido adiposo, sangre periférica y médula ósea. Actualmente, los enfoques más comunes para la purificación y separación de SF-MSCs son citometría de flujo y basado en grano separación inmunomagnética, aunque el método de citometría de flujo requiere un entorno específico y altamente costosos instrumentos13.
Este artículo presenta un procedimiento para la recolección simple y mínimamente invasivo de muestras de líquido sinovial de Nueva Zelanda conejos blancos. Durante el procedimiento, los MSCs rbSF estable expandida en vitro y entonces aislaron con CD90 positivos procedimientos magnéticos basados en grano. Por último, el protocolo muestra cómo se obtiene MSCs con alta pureza y viabilidad de las fuentes de células cosechadas.
En el presente Protocolo, el aislado rbSF-MSCs se caracterizan basado en su morfología, expresión de marcadores específicos y pluripotencia de células madre. Immunophenotyping de basados en citometría de flujo revela una expresión positiva significativa de CD44 y CD105, mientras que la expresión de CD45 y CD34 es negativa. Por último, un ensayo en vitro para MSCs rbSF demuestra la diferenciación osteogénica adipogenic y condrogénica de estas células.
Protocol
Representative Results
Discussion
La existencia de las MSCs en el líquido sinovial proporciona una alternativa para la terapia celular. Estudios anteriores han demostrado que lesiones sitios contienen cantidades más altas de células madre mesenquimales en su líquido sinovial, que puede ser correlacionado positivamente con el período posterior a la lesión5. El MSCs en el líquido sinovial pueden ser beneficiosos al tejido para mejorar la curación espontánea después de una lesión18,<sup c…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado financieramente por las siguientes becas: la Fundación de Ciencias naturales de China (no. 81572198; Nº 81772394); el fondo para la construcción de alto nivel disciplina médica de la Universidad de Shenzhen (Nº 2016031638); la Fundación de investigación médica de la provincia de Guangdong, China (no. A2016314); Shenzhen Ciencia y tecnología proyectos (no. JCYJ20170306092215436; No. JCYJ20170412150609690; No. JCYJ20170413161800287; No. SGLH20161209105517753; No. JCYJ20160301111338144).
Materials
| Reagents | |||
| MesenGro | StemRD | MGro-500 1703 | Warm in 37 °C water bath before use |
| MesenGro Supplement | StemRD | MGro-500 M1512 | Component of MSCs culture medium |
| DMEM basic | Gibco Inc. | C11995500BT | MSCs differentiation medium |
| Isotonic saline solution | Litai, China | 5217080305 | Cavity arthrocentesis procedure reagent |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Inc. | 10099-141 | Component of MSCs culture medium |
| Povidone iodine solution | Guangdong, China | 150605 | Sterilization agent |
| 75% ethanol | Lircon, china | 170917 | Sterilization agent |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | Cell dissociation reagent |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | Component of MSCs medium |
| MACS Running Buffer | MiltenyiBiotec | 5160112089 | Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA |
| CD90 antibody conjugated MicroBeads | MiltenyiBiotec | 5160801456 | For magnetic activated cell sorting |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
| ITS | BD | 354352 | 1%, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P5607 | 0.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | 50 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | 0.5 mM, Component of adipogenic differentiation |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 mM, Component of adipogenic differentiation |
| TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| α-glycerophsphate | Sigma-Aldrich | G6751 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
| CD34 Polyclonal Antibody, FITC Conjugated | Bioss | bs-0646R-FITC | Hematopoietic stem cells marker |
| Mouse antirabbit CD44 | Bio-Rad | MCA806GA | Thy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker) |
| CD45 (Monoclonal Antibody) | Bio-Rad | MCA808GA | Hematopoietic stem cells marker |
| CD105 antibody | Genetex | GTX11415 | MSCs marker |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030 | Precipitates RNA extraction organic phases |
| Trichloromethane | Wenge, China | 61553 | Extract total RNA |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | Isolate total RNA |
| SYBR green master mix | Takara Bio, Japan | RR420A | PCR test |
| cDNA synthesis kit | Takara Bio, Japan | RR047A | Reverse-transcribed to complementary DNA |
| Alizarin Red | Sigma-Aldrich | A5533 | Staining of calcium compounds |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | Staining of cartilaginous tissue |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1391L | Lipid vacuole staining |
| Equipment | |||
| MiniMACS Separator | MiltenyiBiotec | 130-042-102 | For magnetic activated cell sorting |
| MultiStand | MiltenyiBiotec | 130-042-303 | For magnetic activated cell sorting |
| MS Columns | MiltenyiBiotec | 130-042-201 | For magnetic activated cell sorting |
| Cell Strainer | FALCON Inc. | 352340 | 40 μm nylon |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | Cell counting |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | Cell culture dish |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | RNA Extraction and PCR |
| Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | Centrifuge cells |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | Cell culture |
| Real-Time PCR Instrument | Life Tech | QuantStudio | Real-Time quantitative polymerase chain reaction |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 342975 | Cell analyzer |
| Pipettor | Eppendorf | O25456F | Transfer the liquid |
| Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | Isolate and pick individual cell colonies |
| Sterile hypodermic syringe | Double-Dove, China | 131010 | Arthrocentesis procedure |
| Rabbit cage | Zhike, China | ZC-TGD | Restrain the rabbit |
Referenzen
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