Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell
Summary
Dieser Artikel stellt eine einfache und kostengünstige Protokoll für die einfache Isolierung und Reinigung von mesenchymalen Stammzellen aus New Zealand white Kaninchen Gelenkflüssigkeit.
Abstract
Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) sind die wichtigsten Zelle Quelle für zellbasierte Therapien. MSCs von Gelenkflüssigkeit Gelenk Hohlraum könnte für das Tissue Engineering von Knorpelgewebe verwendet werden. MSCs von Gelenkflüssigkeit (SF-MSCs) sind viel versprechende Kandidaten für die artikuläre Regeneration betrachtet worden, und ihre möglichen therapeutische Nutzen hat sie ein wichtiges Forschungsthema des späten. SF-MSCs aus dem Knie Hohlraum der New Zealand white Kaninchen können als eine optimierte translationale Modell eingesetzt werden, menschliche regenerativen Medizin zu beurteilen. Mittels CD90-basierte magnetisch aktivierte Zelle Sortieren (MACS) Technologien dieses Protokoll erfolgreich erhält Kaninchen SF-MSCs (RbSF-MSCs) von diesem Kaninchen-Modell und voll zeigt den MSC-Phänotyp dieser Zellen durch veranlassen, zu unterscheiden Adipozyten Osteoblasten und Chondrozyten. Daher kann dieser Ansatz in Zelle Biologie Forschung und Tissue Engineering mit einfachen Mitteln und Verfahren angewendet werden.
Introduction
MSCs sind als wertvolle Quelle für die regenerative Medizin, speziell für Knorpel Läsionen vorgeschlagen worden. MSCs, einschließlich Chondrozyten, Osteoblasten, Adipozyten, Skelett Myozyten und viszeralen Stromazellen Zellen erweitern im großen und ganzen die Bereiche für stammzelltransplantationen wegen ihrer hohen Ausdehnung Rate und Multi-Linie Differenzierung potenzielle1. MSCs können von den skelettartigen Muskel, Synovialis, dem Knochenmark und Fettgewebe2,3,4isoliert werden. Erkenntnisse haben auch bestätigte die Anwesenheit von MSCs in Gelenkflüssigkeit und die bisherige Forschung hat als aussichtsreiche Kandidaten für artikuläre Regeneration5,6synovial Flüssigkeit abgeleitet MSCs (SF-MSCs) identifiziert.
Forschung und präklinischen Erprobung auf humanen Proben unterliegen jedoch viele ethische Fragen. Stattdessen, Kaninchen wurden und auch weiterhin die am häufigsten verwendeten Tierarten nachweisen, dass die Transplantation von MSCs Knorpelschäden zu reparieren. In den letzten Jahren eine wachsende Zahl von Forschern untersuchten Kaninchen mesenchymalen Stammzellen (RbMSCs) beide in Vitro und in Vivo, als diese Zellen sind ähnlich wie menschliche MSCs in ihrer Biologie und Gewebe Zellphysiologie. Ebenso sind die RbMSCs in der Lage, des Festhaltens an Kunststoffoberflächen, Spindel-Fibroblasten Morphologie wie menschliche MSCs anzeigen. Darüber hinaus sind Kaninchen mesenchymalen Proben einfach und leicht zu7zu erhalten. Darüber hinaus sind die wichtigsten Punkte, dass RbMSCs oberflächenmarker wie CD44, CD90 und CD105, express und Multi-Linie Differenzierungspotenzial erhalten ist, ist in Übereinstimmung mit den Kriterien für die Identifizierung des MSC Populationen als durch die internationale Gesellschaft für Zelltherapie8,9definiert. Synovial Flüssigkeit Chondroprogenitors sind insbesondere in der Lage, nicht Hypertrophe werden wenn durch TGF-β1, wodurch sie geeignete Zelle Quellen für phänotypisch Gelenkknorpel Regeneration10,11induziert, 12.
Die Isolation der SF-MSCs ist jedoch sehr unterschiedlich zu anderen Geweben, einschließlich der Nabelschnur, Fettgewebe, peripherem Blut und Knochenmark. Derzeit sind die am häufigsten verwendeten Ansätze für die Reinigung und Sortierung von SF-MSCs Durchflusszytometrie und Immunomagnetic Wulst-basierte Sortierung, obwohl die Flow-zytometrie-Methode eine spezielle Umgebung und sehr teure Instrumente13 erfordert.
Dieser Artikel stellt ein Verfahren für die einfache und minimal-invasive Entnahme von Proben von Gelenkflüssigkeit aus Neuseeland weiße Kaninchen. Während des Verfahrens der RbSF-MSCs sind stabil erweiterten in-vitro- und dann mit CD90 positive magnetische Wulst-basierte Verfahren isoliert. Das Protokoll zeigt schließlich, wie MSCs mit hoher Reinheit und Wirtschaftlichkeit aus den geernteten Zelle Quellen zu erreichen.
In diesem Protokoll zeichnen sich die isolierte RbSF-MSCs anhand ihrer Morphologie, Ausdruck spezifischer Marker und Pluripotenz Stammzellen zu gewinnen. Flow Cytometry-basierte Immunphänotypisierung zeigt einen signifikanten positive Ausdruck CD44 und CD105, während der Ausdruck von CD45 und CD34 negativ ist. Schließlich zeigt ein in-vitro- Test für RbSF-MSCs osteogene adipogenen und Chondrogenic Differenzierung der Zellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Vorhandensein von MSCs in Gelenkflüssigkeit bietet eine Alternative für zellbasierte Therapien. Frühere Studien haben gezeigt, dass Verletzungen Websites höhere Mengen an mesenchymalen Stammzellen in die Gelenkflüssigkeit enthalten, die mit dem posttraumatischen Periode5positiv korreliert werden kann. Die MSCs in Gelenkflüssigkeit können Gewebe für die Verbesserung der spontanen Heilung nach einer Verletzung18,19hilfreich sein….
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde finanziell unterstützt durch die folgende Zuschüsse: Natural Science Foundation of China (Nr. 81572198; (Nr. 81772394); der Fonds für hohe Niveau medizinische Disziplin Bau von Shenzhen-Universität (Nr. 2016031638); die medizinische Forschung Grundlage der Guangdong Provinz, China (Nr. A2016314); Shenzhen-Wissenschaft und Technologie-Projekte (No. JCYJ20170306092215436; Nein. JCYJ20170412150609690; Nein. JCYJ20170413161800287; Nein. SGLH20161209105517753; Nein. JCYJ20160301111338144).
Materials
| Reagents | |||
| MesenGro | StemRD | MGro-500 1703 | Warm in 37 °C water bath before use |
| MesenGro Supplement | StemRD | MGro-500 M1512 | Component of MSCs culture medium |
| DMEM basic | Gibco Inc. | C11995500BT | MSCs differentiation medium |
| Isotonic saline solution | Litai, China | 5217080305 | Cavity arthrocentesis procedure reagent |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Inc. | 10099-141 | Component of MSCs culture medium |
| Povidone iodine solution | Guangdong, China | 150605 | Sterilization agent |
| 75% ethanol | Lircon, china | 170917 | Sterilization agent |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | Cell dissociation reagent |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | Component of MSCs medium |
| MACS Running Buffer | MiltenyiBiotec | 5160112089 | Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA |
| CD90 antibody conjugated MicroBeads | MiltenyiBiotec | 5160801456 | For magnetic activated cell sorting |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
| ITS | BD | 354352 | 1%, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P5607 | 0.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | 50 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | 0.5 mM, Component of adipogenic differentiation |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 mM, Component of adipogenic differentiation |
| TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
| α-glycerophsphate | Sigma-Aldrich | G6751 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
| CD34 Polyclonal Antibody, FITC Conjugated | Bioss | bs-0646R-FITC | Hematopoietic stem cells marker |
| Mouse antirabbit CD44 | Bio-Rad | MCA806GA | Thy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker) |
| CD45 (Monoclonal Antibody) | Bio-Rad | MCA808GA | Hematopoietic stem cells marker |
| CD105 antibody | Genetex | GTX11415 | MSCs marker |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030 | Precipitates RNA extraction organic phases |
| Trichloromethane | Wenge, China | 61553 | Extract total RNA |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | Isolate total RNA |
| SYBR green master mix | Takara Bio, Japan | RR420A | PCR test |
| cDNA synthesis kit | Takara Bio, Japan | RR047A | Reverse-transcribed to complementary DNA |
| Alizarin Red | Sigma-Aldrich | A5533 | Staining of calcium compounds |
| Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | Staining of cartilaginous tissue |
| Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1391L | Lipid vacuole staining |
| Equipment | |||
| MiniMACS Separator | MiltenyiBiotec | 130-042-102 | For magnetic activated cell sorting |
| MultiStand | MiltenyiBiotec | 130-042-303 | For magnetic activated cell sorting |
| MS Columns | MiltenyiBiotec | 130-042-201 | For magnetic activated cell sorting |
| Cell Strainer | FALCON Inc. | 352340 | 40 μm nylon |
| Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | Cell counting |
| Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | Cell culture dish |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | RNA Extraction and PCR |
| Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | 91050 | Gamma-sterilized |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | Centrifuge cells |
| Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | Cell culture |
| Real-Time PCR Instrument | Life Tech | QuantStudio | Real-Time quantitative polymerase chain reaction |
| Flow cytometer | BD Biosciences | 342975 | Cell analyzer |
| Pipettor | Eppendorf | O25456F | Transfer the liquid |
| Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | Isolate and pick individual cell colonies |
| Sterile hypodermic syringe | Double-Dove, China | 131010 | Arthrocentesis procedure |
| Rabbit cage | Zhike, China | ZC-TGD | Restrain the rabbit |
Referenzen
- Oreffo, R. O., Cooper, C., Mason, C., Clements, M. Mesenchymal stem cells: lineage, plasticity, and skeletal therapeutic potential. Stem Cell Reviews. 1 (2), 169-178 (2005).
- Asakura, A., Rudnicki, M. A., Komaki, M. Muscle satellite cells are multipotential stem cells that exhibit myogenic, osteogenic, and adipogenic differentiation. Differentiation. 68 (4-5), 245-253 (2001).
- De, B. C., Dell’Accio, F., Tylzanowski, P., Luyten, F. P. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane. Arthritis Rheumatology. 44 (8), 1928-1942 (2001).
- Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
- McGonagle, D., Jones, E., English, A., Emery, P. Enumeration and phenotypic characterization of synovial fluid multipotential mesenchymal progenitor cells in inflammatory and degenerative arthritis. Arthritis & Rheumatism. 50 (3), 817-827 (2004).
- Jia, Z., et al. Isolation and characterisation of human mesenchymal stem cells derived from synovial fluid by magnetic activated cell sorting (MACS). Cell Biology International. , (2017).
- Bashir, M., et al. Isolation, culture and characterization of New Zealand white rabbit mesenchymal stem cells derived from bone marrow. Asian Journal of Animal & Veterinary Advances. 10 (8), 13-30 (2015).
- Song, X., et al. Differentiation potential of rabbit CD90-positive cells sorted from adipose-derived stem cells in vitro. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 53 (1), 1-6 (2016).
- Lee, T. C., et al. Comparison of surface markers between human and rabbit mesenchymal stem cells. PLOS One. 9 (11), e111390 (2014).
- Stewart, M. C., Chen, Y., Bianchessi, M., Pondenis, H. Phenotypic characterization of equine synovial fluid-derived chondroprogenitor cells. Stem Cell Biology and Research. 3 (1), (2016).
- Prado, A. A. F., et al. Characterization of mesenchymal stem cells derived from the equine synovial fluid and membrane. BioMed Central Veterinary Research. 11 (1), 281 (2015).
- Yoshimura, H., et al. Comparison of rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow, synovium, periosteum, adipose tissue, and muscle. Cell and Tissue Research. 327 (3), 449-462 (2007).
- Wu, C. C., et al. Intra-articular injection of platelet-rich fibrin releasates in combination with bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of articular cartilage defects: an in vivo study in rabbits. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (6), 1536-1543 (2017).
- John, T., Lerche, P. . Anesthesia and Analgesia for Veterinary Technicians. , (2011).
- Koyama, N., et al. Pluripotency of mesenchymal cells derived from synovial fluid in patients with temporomandibular joint disorder. Life Sciences. 89 (19-20), 741-747 (2011).
- Kim, Y. S., et al. Isolation and characterization of human mesenchymal stem cells derived from synovial fluid in patients with osteochondral lesion of the talus. American Journal of Sports Medicine. 43 (2), 399-406 (2015).
- Vereb, Z., et al. Immunological properties of synovial fluid-derived mesenchymal stem cell-like cells in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 74 (Suppl 1), A64-A65 (2015).
- Matsukura, Y., Muneta, T., Tsuji, K., Koga, H., Sekija, I. Mesenchymal stem cells in synovial fluid increase after meniscus injury. Clinical Orthopaedics & Related Research. 472 (5), 1357-1364 (2014).
- Morito, T., et al. Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans. Rheumatology. 47 (8), 1137-1143 (2008).
- Hegewald, A. A., et al. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue & Cell. 36 (6), 431-438 (2004).
- Jones, E. A., et al. Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: detection and functional evaluation at the single cell level. Arthritis & Rheumatism. 58 (6), 1731-1740 (2008).
- Makker, K., Agarwal, A., Sharma, R. K. Magnetic activated cell sorting (MACS): utility in assisted reproduction. Indian Journal of Experimental Biology. 46 (7), 491-497 (2008).
- Schmitz, B., et al. Magnetic activated cell sorting (MACS) — a new immunomagnetic method for megakaryocytic cell isolation: comparison of different separation techniques. European Journal of Haematology. 52 (5), 267-275 (1994).
- Reinhardt, M., Bader, A., Giri, S. Devices for stem cell isolation and delivery: current need for drug discovery and cell therapy. Expert Review of Medical Devices. 12 (3), 353-364 (2015).
- Gronthos, S., Zannettino, A. C. W., Prockop, D. J., Bunnell, B. A., Phinney, D. G. A method to isolate and purify human bone marrow stromal stem cells. Mesenchymal Stem Cells. , 45-57 (2008).
- Krawetz, R. J., et al. Synovial fluid progenitors expressing CD90+ from normal but not osteoarthritic joints undergo chondrogenic differentiation without micro-mass culture. PLOS One. 7 (8), e43616 (2012).
- Ogata, Y., et al. Purified human synovium mesenchymal stem cells as a good resource for cartilage regeneration. PLOS One. 10 (6), e0129096 (2015).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells: the International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Gauci, S. J., et al. Modulating chondrocyte hypertrophy in growth plate and osteoarthritic cartilage. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interact. 8 (4), 308 (2008).
- Cooke, M. E., et al. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with chondrocytes promotes chondrogenic differentiation without hypertrophy. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (10), 1210-1218 (2011).
- Fischer, J., Dickhut, A., Rickert, M., Richter, W. Human articular chondrocytes secrete parathyroid hormone-related protein and inhibit hypertrophy of mesenchymal stem cells in coculture during chondrogenesis. Arthritis and Rheumatism. 62 (9), 2696-2706 (2010).
