La détermination de la spécificité de la protéase dans les tissus de souris extraits par spectrométrie de masse MALDI-TOF : manipulation PH afin de provoquer des modifications de la spécificité
Summary
Nous présentons ici un protocole pour déterminer la spécificité de la protéase dans les tissus de souris brut extraits par spectrométrie de MALDI-TOF.
Abstract
Protéases ont plusieurs fonctions biologiques, y compris la digestion des protéines activation/inactivation et la nourriture. Identifier la spécificité de la protéase est important pour avoir révélé les fonction de protéase. La méthode proposée dans la présente étude détermine la spécificité de la protéase en mesurant le poids moléculaire de substrats uniques à l’aide de désorption/ionisation Laser assistée par matrice spectrométrie de masse à temps de vol (MALDI-TOF). Les substrats contiennent des iminobiotin, tandis que le site clivé est composé d’acides aminés et l’entretoise est constitué de polyéthylène glycol. Le substrat clivé générera un poids moléculaire unique à l’aide d’un acide aminé clivé. L’un des mérites de cette méthode est qu’elle peut être réalisée dans un pot à l’aide d’échantillons bruts, et il est également approprié pour l’évaluation des échantillons multiples. Dans cet article, nous décrivons une méthode expérimentale simple optimisée avec des échantillons extraits de tissus pulmonaires de souris, y compris l’extraction tissulaire, placement des substrats digestifs dans des échantillons, purification des substrats digestifs dans des conditions de pH différents et mesure le poids moléculaire des substrats par spectrométrie de masse MALDI-TOF. En résumé, cette technique permet l’identification de la spécificité de la protéase dans les échantillons bruts provenant d’extraits de tissus à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI-TOF, qui peut facilement être ajustée vers le haut pour le traitement des échantillons multiples.
Introduction
Protéases régulent les processus physiologiques par clivage des protéines, et l’initiation de l’activité de la protéase à certains moments et endroits est réglé1. Il est donc important d’identifier l’expression et l’activité des tissus qui sont réglementés localement et de développer une nouvelle méthode pour détecter les protéases. La méthode proposée dans la présente étude vise à identifier la spécificité de la protéase en parallèle afin de détecter les protéases.
Il y a quelques méthodes pour détecter la spécificité de la protéase. La méthode azocaséine est bien connue pour son utilisation dans la détection des protéases2 mais est limitée dans sa capacité à obtenir des informations complémentaires. Zymographie est une autre méthode de détection de protéase complète qui peut être utilisée pour déterminer le poids moléculaire de protéases3, mais il ne peut pas servir à examiner la spécificité de substrat. Spécificité de protéase peut être déterminée par les analyses spectrométriques, en utilisant des substrats tels que p-nitroanilide4et essais fluorimétrique, à l’aide de substrats de coumarine5 ou Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) essais6. Ces méthodes permettent la détection de single-spécificité des substrats contenues dans un seul puits. Dans la présente étude, la spécificité de la protéase des extraits de tissus est examinée dans diverses conditions, car ces extraits contiennent plusieurs protéases. Activité de la protéase est régie par plusieurs facteurs, notamment le pH, coenzymes, groupes prosthétiques et force ionique. Récemment, des méthodes axées sur la protéomique ont été utilisés pour identifier la spécificité de la protéase ; par exemple, la méthode mentionnée par Biniossek et al. 7 le protéome pour déterminer la spécificité de substrat même dans des extraits bruts et permet une détermination précise de l’activité de clivage des protéases qui tiennent compte de plusieurs acides aminés séquences8. Toutefois, cette méthode ne consiste pas pour l’analyse de nombreux échantillons. En revanche, notre méthode permet le traitement simultané de plusieurs échantillons et l’utilisation de Matrix-Assisted Laser désorption-ionisation Time-of-Flight (MALDI-TOF) spectrométrie de masse pour l’analyse de l’échantillon facilite la détection rapide et facile de la clivés substrats.
Le présent document décrit une méthode permettant d’évaluer la spécificité de protéase à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI-TOF pour mesurer le poids moléculaire de substrats uniques. Les formes moléculaires de substrats clivés, ainsi que leurs poids moléculaires théoriques, sont indiquées dans la Figure 1 et tableau 1. Des études antérieures ont utilisé des substrats contenant polyglycine entretoises et biotine9; Toutefois, ces substrats sont imparfaites parce que la séquence de polyglycine peut être clivée par des enzymes qui reconnaissent la séquence glycine. En outre, la forte affinité entre l’avidine et biotine peut conduire à un taux de récupération faible. Afin d’améliorer ces inconvénients, dans cette étude, que nous avons synthétisé un support unique qui était composé de polyéthylène glycol (PEG), iminobiotin et un acide aminé qui pouvait identifier le site de clivage (Figure 1). D’établir une discrimination entre les acides aminés de poids moléculaires semblables, la D-sérine a été ajoutée entre l’entretoise de PEG et de l’acide aminé du site clivées.
Le N-terminal du substrat a été marqué avec iminobiotin, qui permet la purification d’affinité des échantillons bruts. L’utilisation d’iminobiotin au lieu de biotine est critique ; Biotine a une forte affinité avec l’avidine, qui se traduit par des faibles taux de récupération des substrats biotine-étiquetés de la résine de l’avidine, tandis que l’affinité d’iminobiotin pour l’avidine peut être modifiée par pH. Marqué Iminobiotin substrats seront liera à avidine dans des conditions au-dessus de pH 9, tandis qu’avidine libère des substrats marqués au iminobiotin en conditions en dessous de pH 4. Par conséquent, iminobiotin a été utilisé pour affinité purification10. En résumé, les auteurs décrivent un protocole détaillé pour détecter les spécificité de protéase en utilisant des substrats uniques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole utilise la spectrométrie de masse MALDI-TOF pour identifier la spécificité de la protéase dans les échantillons bruts provenant d’extraits de tissus et peut facilement être ajustée vers le haut pour le traitement des échantillons multiples. En particulier, nous avons manipulé le pH afin de provoquer un changement de spécificité de substrat.
La méthode avidine-biotine complexe (ABC), qui a été largement utilisée en biochimie en raison de sa spécificité de liaison…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par la subvention de recherche de l’Université Nihon pharmaceutique de Nihon Pharmaceutical University (2016) et le MEXT KAKENHI Grant nombre JP17854179.
Materials
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
Referenzen
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