La determinazione della specificità della proteasi nel Mouse tessuto estratti mediante spettrometria di massa MALDI-TOF: manipolazione di PH per causare i cambiamenti di specificità
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per determinare la specificità di proteasi in tessuto grezzo del mouse estratti usando spettrometria MALDI-TOF.
Abstract
Proteasi hanno diverse funzioni biologiche, tra cui la digestione della proteina di attivazione/inattivazione e cibo. Identificazione della proteasi specificità è importante per rivelare la funzione di proteasi. Il metodo proposto in questo studio determina la specificità della proteasi misurando il peso molecolare dell’unici substrati utilizzando Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization spettrometria di massa di tempo di volo (MALDI-TOF). I substrati contengono iminobiotin, mentre il sito fenduto è composto da aminoacidi, e il distanziatore è costituito da polietilene glicole. Il substrato fenduto genererà un unico peso molecolare usando un aminoacido spaccato. Uno dei meriti di questo metodo è che può essere effettuata in una pentola utilizzando campioni di greggi, ed è anche adatto per valutare campioni multipli. In questo articolo, descriviamo un metodo sperimentale semplice ottimizzato con campioni estratti dal tessuto polmonare di topo, compresa l’estrazione del tessuto, inserimento di substrati digestivi in campioni, purificazione dei substrati digestivi in condizioni di pH diversi e la misurazione del peso molecolare dei substrati utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF. In sintesi, questa tecnica consente l’identificazione della specificità di proteasi in campioni grezzi derivati da estratti di tessuto mediante spettrometria di massa MALDI-TOF, che facilmente può essere scalata per elaborazione di campione più.
Introduction
Proteasi regolano processi fisiologici fendendo proteine, e l’avvio di attività di proteasi a orari specifici e posizioni è regolato1. Pertanto è importante per identificare l’espressione e l’attività dei tessuti che sono regolate localmente e per sviluppare un nuovo metodo per rilevare le proteasi. Il metodo proposto questo studio mira a identificare le specificità di proteasi in parallelo al rilevamento di proteasi.
Ci sono alcuni metodi per la rilevazione di specificità di proteasi. Il metodo azocaseina è ben noto per il suo utilizzo nella rilevazione di proteasi2 ma è limitato nella sua capacità di ottenere ulteriori informazioni. Zymography è un altro metodo di rilevamento di proteasi completa che può essere utilizzato per determinare il peso molecolare di proteasi3, ma non può essere utilizzato per esaminare la specificità di substrato. Specificità della proteasi può essere determinato dalle analisi spettrometriche, utilizzando substrati quali p-nitroanilide4e le analisi fluorometriche, utilizzando substrati di cumarina5 o fluorescenza Resonance Energy Transfer (FRET) saggi6. Questi metodi consentono la rilevazione di singolo-specificità dei substrati contenute in un singolo pozzo. Nello studio presente, la specificità di proteasi di estratti di tessuto viene esaminata in varie condizioni, come questi estratti contengono proteasi multiple. L’attività della proteasi è regolata da diversi fattori, tra cui pH, coenzimi, gruppi prostetici e resistenza dello ione. Recentemente, metodi basati sulla proteomica sono state usate per identificare la specificità della proteasi; ad esempio, il metodo riportato da Biniossek et al. 7 utilizza il proteoma per determinare la specificità di substrato anche in estratti grezzi e consente la determinazione accurata dell’attività delle proteasi che riconoscono più dell’amminoacido sequenze8clivaggio. Tuttavia, questo metodo non è adatto per l’analisi di numerosi campioni. Al contrario, il nostro metodo consente l’elaborazione simultanea di più campioni e l’uso di Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) spettrometria di massa per l’analisi facilita la rilevazione rapida e facile della spaccati substrati.
Questa carta descrive un metodo per valutare la specificità della proteasi mediante spettrometria di massa MALDI-TOF per misurare il peso molecolare di substrati unici. Le forme molecolari di substrati spaccati, insieme al loro peso molecolare teorico, sono mostrate in Figura 1 e tabella 1. Gli studi precedenti hanno usato substrati contenenti polyglycine distanziali e biotina9; Tuttavia, questi substrati sono viziati perché la sequenza di polyglycine può essere clivata da enzimi che riconoscono la sequenza di glicina. Inoltre, l’alta affinità tra avidina e la biotina può portare a un tasso basso di recupero. Per migliorare questi inconvenienti, in questo studio che abbiamo sintetizzato un substrato unico, che era composta di polietilenglicole (PEG), iminobiotin e un aminoacido che potrebbe identificare il sito di clivaggio (Figura 1). Per discriminare tra amminoacidi di simili pesi molecolari, D-serina è stato aggiunto tra il distanziale di PEG e dell’aminoacido nel sito spaccati.
il N-terminale del substrato è stato etichettato con iminobiotin, che permette la purificazione di affinità da campioni di greggi. L’uso di iminobiotin invece di biotina è critico; la biotina ha una forte affinità con avidina, che si traduce in tassi di recupero basso di biotina substrati da resina avidina, mentre affinità di iminobiotin per avidina può essere alterato da pH. Iminobiotin-etichettati substrati legheranno per avidina in condizioni sopra pH 9, mentre avidina rilascia iminobiotin-etichettati substrati in condizioni sotto pH 4. Pertanto, iminobiotin è stato usato per la purificazione di affinità10. In breve, descriviamo un protocollo dettagliato per la rilevazione di specificità di proteasi utilizzando substrati unici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo utilizza la spettrometria di massa MALDI-TOF per identificare specificità di proteasi in campioni grezzi derivati da estratti di tessuto e facilmente può essere scalato per elaborazione di campione più. In particolare, abbiamo maneggiato pH per causare un cambiamento nella specificità di substrato.
Il metodo (ABC) complesso avidina-biotina, che è stato ampiamente usato in biochimica a causa della sua specificità di legame, è stato utilizzato nel nostro protocollo. A ca…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato in parte da Nihon farmaceutica University Research Grant da Nihon Pharmaceutical University (2016) e il JP17854179 di numero di MEXT KAKENHI Grant.
Materials
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
Referenzen
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