MALDI-TOF 質量分析法によるマウス組織におけるプロテアーゼの特異性の定量抽出: 特異性変化を引き起こすに PH を操作します。
Summary
ここでは、飛行時間分析法を用いた抽出提案原油マウス組織におけるプロテアーゼの特異性を決定するためのプロトコル。
Abstract
プロテアーゼは、タンパク質の活性化/不活性化し、食品の消化を含むいくつかの生物学的機能をあります。プロテアーゼの特異性を識別するは、プロテアーゼの機能を明らかにするため重要です。本研究で提案する手法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化を用いたユニークな基板の分子量を測定することによってプロテアーゼの特異性を決定飛行時間 (MALDI-TOF) 質量分析法。基板には、劈開サイトはアミノ酸で構成されていますが、スペーサーはポリエチレング リコールで構成されています iminobiotin が含まれています。劈開の基板に裂かれたアミノ酸を使用してユニークな分子量が生成されます。この方法のメリットは、原油のサンプルを使用して 1 つの鍋で実施されることがあります、それはまた複数のサンプルの評価に適しているがあります。この資料で述べる組織抽出、異なる pH 条件下で消化器系基板の精製サンプルに消化器系基板の配置を含むマウス肺組織から抽出したサンプルと最適化された簡単な実験方法、と MALDI-TOF 質量分析法による基板の分子量の測定。要約すると、この手法を簡単に複数のサンプル処理のスケール アップが MALDI-TOF 質量分析法による組織の抽出物から派生した原油のサンプルにおけるプロテアーゼの特異性の識別できます。
Introduction
プロテアーゼはタンパク質を切断し生理学的なプロセスを規制する、特定の時間と場所でプロテアーゼ活性の開始は規制1。したがって、式と規制されてローカル組織の活動を識別するためにプロテアーゼを検出する手法を開発することが重要です。方法を提案するプロテアーゼの検出と並行してプロテアーゼの特異性を識別するために本研究の目的です。
プロテアーゼの特異性を検出するためのいくつかの方法があります。着色方法がプロテアーゼ2の検出に使用するためよく知られている詳細情報を取得する能力が限られています。ザイモグラフィーはプロテアーゼ3分子量を決定するため使用することができます別の包括的なプロテアーゼ検出法が、基質特異性を調べるには使用できません。プロテアーゼの特異性は、p-ニトロアニリド水解活性4など基板を用いた分光測定法と蛍光アッセイ、クマリン基板5または6蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) 試金を使用してによって決定できます。これらのメソッドは、単一の井戸に含まれる基質の単一特異性検出を有効にします。本研究ではこれらの抽出物を含む複数のプロテアーゼ、さまざまな条件の下でティッシュ エキスのプロテアーゼの特異性を検討します。プロテアーゼ活性は、pH、補酵素、補欠分子族とイオン強度を含むいくつかの要因によって調整されます。プロテオミクスに基づく方法がプロテアーゼの特異性; を識別するために使用されている最近、たとえば、メソッドは Biniossekらによって報告されました。7プロテオーム粗抽出物中も基質特異性を決定し、複数アミノ酸シーケンス8を認識プロテアーゼの切断活性の正確な定量をことができます。ただし、このメソッドは、多数の試料の分析に適してではありません。対照的に、この手法により複数のサンプルの同時処理および使用のマトリックス レーザー脱離イオン化飛行時間 (MALDI-TOF) サンプル分析のための質量分析法、劈開の簡便・迅速な検出を容易に基板。
このペーパーは、ユニークな基質の分子量を測定する MALDI-TOF 質量分析法を用いたプロテアーゼの特異性を評価する方法を説明します。と一緒に彼らの理論分子量の劈開基板の分子形態は、図 1と表 1に表示されます。以前の研究は、ポリグリシン スペーサーとビオチン9; を含む培地を使用しています。ただし、ポリグリシン シーケンスは、グリシンのシーケンスを認識する酵素によって裂かれることがありますので、このような基板が欠点があります。さらに、低回収率アビジンとビオチンとの親和性が高い可能性があります。我々 は、ポリエチレング リコール (PEG)、iminobiotin、および胸の谷間サイト (図 1) を識別することができるアミノ酸で構成されたユニークな基板を合成したこの研究では、これらの欠点を改良します。同じような分子量のアミノ酸を区別するには、PEG スペーサーと劈開サイトでアミノ酸 D-セリンをされました。
基質の N 末端は、原油由来の親和性の浄化を可能にする iminobiotin が付いていた。ビオチンではなく iminobiotin の使用が重要です。ビオチン、アビジンは、ビオチン標識アビジン樹脂基板上の低回収率アビジンの iminobiotin の親和性は pH によって変更できます、結果強い親和性。Iminobiotin というラベルの付いた基板は、アビジンは pH 4 以下の条件で基板上の iminobiotin ラベルを解放しながら pH 9、上記の条件でアビジンにバインドします。したがって、iminobiotin は、アフィニティ精製10に使われました。要約すると、ユニークな基板を用いたプロテアーゼの特異性を検出するための詳しいプロトコルについて述べる。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、原油サンプル ティッシュ エキス由来のプロテアーゼの特異性を識別するために MALDI-TOF 質量分析法を使用し、簡単に複数のサンプル処理のスケール アップがあります。特に、我々 は基質特異性の変化を引き起こすに pH を操作しました。
生物化学結合特異性のために広く使用されているアビジン-ビオチン複合 (ABC) 法では、我々 のプロトコルで利用?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、一部に日本薬科大学 (2016) から文部科学省科研費助成番号 JP17854179 日本医薬大学研究助成によって支えられました。
Materials
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
Referenzen
- Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
- Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
- Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
- Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
- Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
- Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
- Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
- Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
- Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
- Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
- Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
- Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
- Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
- Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).
