نموذج اعتلال عضلة القلب الناجم عن ميتوتريكسات في الزرد الكبار
Summary
يتم وصف أسلوب لإنشاء نموذج اعتلال عضلة القلب الناجم عن ميتوتريكسات في الزرد الكبار (دانيو rerio) هنا. طريقتين بديل للحقن داخل وتعرض وتناقش شروط لتقليل الاختلافات بين مختلف مجموعات تجريبية.
Abstract
قد استخدمت الزرد الكبار وراثيا موجوداً (دانيو rerio) متزايدة كنموذج فقاريات لفهم الأمراض البشرية مثل اعتلال عضلة القلب. بسبب الراحة وقابليتها للمعالجات الجينية عالية الإنتاجية، توليد نماذج المكتسبة باعتلال عضلة القلب، مثل نموذج ميتوتريكسات الناجمة عن اعتلال عضلة القلب (DIC) في الزرد الكبار، هو فتح أبواب مجالات بحثية جديدة، بما في ذلك اكتشاف معدلات اعتلال عضلة القلب عن طريق الفحص الجيني إلى الأمام. يختلف عن النموذج DIC الزرد الجنينية، الأولى الحاد والمزمن مراحل اعتلال عضلة القلب في وقت لاحق يمكن تحديدها في النموذج DIC الزرد الكبار، مما يتيح دراسة آليات تعتمد على مرحلة الإشارات والاستراتيجيات العلاجية. ومع ذلك، يمكن الحصول على نتائج متغير مع الطراز الحالي، حتى في أيدي محققين ذوي خبرة. لتيسير تنفيذ نموذج DIC في المستقبل، نقدم بروتوكول مفصلة حول كيفية إنشاء هذا النموذج DIC في الزرد الكبار ووصف طريقتين بديل للحقن (الملكية الفكرية) داخل. نحن مناقشة الخيارات بشأن كيفية الحد من التفاوتات في الحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها وتقدم اقتراحات بشأن كيفية تفسير النتائج على نحو مناسب.
Introduction
وضعت ميتوتريكسات (دوكس)، كما يدعى Adriamycin، كالعقاقير المضادة الورم منذ الستينات1،2. الآن ما زال بنشاط كالمخدرات العلاج الكيميائي مهم لنطاق عريض من الأورام. ومع ذلك، التطبيق السريري دوكس أعاقها عن السمية تعتمد على الجرعة، وخاصة كارديوتوكسيسيتي تتميز بأعراض متغيرة تتراوح بين التغييرات electrocardiographic أعراض التهاب التامور والتليف اعتلال عضلة القلب 1 , 2-وحتى الآن، أثارت الفرضيات الرئيسية الثلاثة على الأقل لشرح مدينة دبي للإنترنت، بما في ذلك تنشيط الأكسجين التفاعلية الأنواع (روس)1،3،4،5، تثبيط topoisomerase (ثانيا-β 6،TOP2β)7، والتحوير للكالسيوم داخل الخلية الإصدار1،،من89. تتراكم الأدلة تشير أيضا إلى الاستعداد الوراثي كعامل خطر رئيسي لمدينة دبي للإنترنت10،11،،من1213. الهويات الجينات ذات الصلة بهذه الميول DIC، مع ذلك، لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. ديكسرازوكساني هو عامل adjuvant فقط وافق “لنا الغذاء” والدواء (FDA) لعلاج DIC، لكن مع التنفيذ المحدود14،،من1516، مما يؤكد الحاجة إلى تحديد إضافية الاستراتيجيات العلاجية. ولذلك يتم استكشاف نماذج حيوانية لمدينة دبي للإنترنت لهذه الأغراض. نظراً لإمكانية الوصول والبساطة، الدراسات الميكانيكية في مدينة دبي للإنترنت نماذج يمكن أن يكون آثار أوسع نطاقا في أنواع أخرى من القلب: المرضية المشتركة قد تكون مشتركة بين القلب مسببات مختلفة، لا سيما في لاحقاً المراحل المرضية17،18،،من1920.
بالإضافة إلى نماذج القوارض من مدينة دبي للإنترنت، تم تطوير نماذج DIC الزرد بإنتاجية أعلى لتسهيل اكتشاف العوامل الوراثية الجديدة والمداواة. أنشئ نموذج DIC جنينية في الأجنة الزرد شفافة لفحص المركبات العلاجية21. نظراً لأن القلب أمراض ظهور الكبار مع المرضية تدريجيا، اعتلال عضلة القلب الزرد الكبار نماذج تم وضع22،،من2324،،من2526. ونحن إنشاء أول نموذج المكتسبة لاعتلال عضلة القلب الناجمة عن فقر الدم المزمن24، تليها مدينة دبي للإنترنت كنموذج المكتسبة باعتلال عضلة القلب الثاني في الزرد الكبار23. ووجدنا أن حقن بولس واحد من دوكس في الزرد الكبار يدفع كارديوتوكسيسيتي يتكون من مرحلة حادة تقريبا خلال أسبوع واحد بعد انتهاء الحقن (wpi)، تليها مرحلة مزمنة من اعتلال عضلة القلب إلى 6 أشهر بعد الحقن. بينما هابلوينسوفيسينسي الهدف آليا من ربمسن(mtor) يساعد اعتلال عضلة القلب الذي يبالغ في المرحلة المزمنة، وفيات الأسماك في المرحلة الحادة، مما يؤكد قيمة النموذج DIC الكبار نستشف تعتمد على المرحلة 23من الآليات. كذلك أثبتنا أنه يمكن استخدام نموذج DIC الكبار التأكيد على مجموعة من الزرد insertional القلب (ZIC) طفرات التي تتولد عن طريق نهج القائم على ينقول الطفرات insertional27. شاشة تجريبية حددت 3 الجينات المعروفة اعتلال عضلة القلب، فضلا عن 6b دناج (Hsp40) هومولوج، الفصيلية ب والأعضاء (dnajb6b) كالجديدة DIC قابلية الجينات28. ولذلك، أدت توليد نموذج DIC الكبار في الزرد إلى منهجية جديدة تمكن بصورة منهجية تحديد المعدلات الوراثية لمدينة دبي للإنترنت، التي تكمل القائمة على نطاق الجينوم جمعية دراسة (جواس) ومحور الصفات الكمية (QTL ) التحليل.
وخلال جيل وتنفيذ نموذج DIC الزرد الكبار، لاحظنا وجود تباينات كبيرة فيما بين الباحثين مختلفة و/أو حتى بين الحقن المختلفة التي يقوم بها المحقق نفسه. طبيعة طولية من الطراز يفرض تحديات لتسجيل النتائج من المحققين مختلفة وفي عملية استكشاف الأخطاء وإصلاحها متسلسلة. لتسهيل استخدام هذا الذي يحفز اعتلال عضلة القلب الإجهاد طريقة بسيطة من مجتمع البحث، يمكننا وصف لنا البروتوكول بالتفصيل، هذا نوعين من الحقن بالملكية الفكرية، ومناقشة اعتبارات الحد من التباينات بين مختلف الباحثين.
Protocol
Representative Results
Discussion
نموذج DIC تدريجي، لتم تحديد جرعة 20 ملغ/كغ دوكس تجريبيا كأعلى جرعة التي لا تتسبب في موت الأسماك الكبيرة خلال 1 wpi لكن النتائج لا تزال في موت الأسماك والحد من وظيفة القلب بعد wpi 4 (الشكل 3 و 4 الشكل). هذه الجرعة مماثلة لتلك التي يكثر استخدامها في نماذج DIC القوارض (15-25 …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمها جزئيا “منحة تنمية عالم” من “جمعية القلب الأمريكية” (14SDG18160021 إلى YD)، R01 المعاهد الوطنية للصحة في “الولايات المتحدة” يمنح HL 81753 و 107304 HL إلى XX، ومؤسسة مايو كلينيك إلى س س.
Materials
| Crossing tank | Aquaneering | ZHCT100 | Fish breeding |
| Incubator | ThermoFisher | Maintaining embryo | |
| 3 L medium tank | Aquaneering | ZT280 | Maintaining fish |
| Paramecia | Carolina | 131560 | Food for juvenile fish |
| Live hatched brine shrimp | in house | Food for adult fish | |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | |
| 1.5 ml safe-lock tube | Eppendorf | No. 022363204 | For drug storage |
| Aluminum foil paper | Fisher | 1213104 | For preventing light exposure |
| Proteinase K | Roche | No. 03115887001 | For dechorionating embryo |
| Hank's balanced salt solution (HBBS) | ThermoFisher | 14025076 | Vehicle for DOX |
| 100 mm petri dish | Falcon | 431741 | |
| 10 μL NanoFil micro-syringe | WPI | NANOFIL | For injection |
| 34 gauge needle | WPI | NF34BV-2 | For injection |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthetizing fish |
| 96 well plate | Costar | 3539 | For embryo drug treatment |
| Transfer pipette | Bel-art product | F37898 | For transfering embryo |
Referenzen
- Octavia, Y., et al. Doxorubicin-induced cardiomyopathy: from molecular mechanisms to therapeutic strategies. J Mol Cell Cardiol. 52 (6), 1213-1225 (2012).
- Singal, P. K., Iliskovic, N. Doxorubicin-induced cardiomyopathy. N Engl J Med. 339 (13), 900-905 (1998).
- Angsutararux, P., Luanpitpong, S., Issaragrisil, S. Chemotherapy-Induced Cardiotoxicity: Overview of the Roles of Oxidative Stress. Oxid Med Cell Longev. , 795602 (2015).
- Ichikawa, Y., et al. Cardiotoxicity of doxorubicin is mediated through mitochondrial iron accumulation. J Clin Invest. 124 (2), 617-630 (2014).
- Zhang, Y. W., Shi, J., Li, Y. J., Wei, L. Cardiomyocyte death in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 57 (6), 435-445 (2009).
- Sawyer, D. B. Anthracyclines and heart failure. N Engl J Med. 368 (12), 1154-1156 (2013).
- Zhang, S., et al. Identification of the molecular basis of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nat Med. 18 (11), 1639-1642 (2012).
- Dodd, D. A., et al. Doxorubicin cardiomyopathy is associated with a decrease in calcium release channel of the sarcoplasmic reticulum in a chronic rabbit model. J Clin Invest. 91 (4), 1697-1705 (1993).
- Mitry, M. A., Edwards, J. G. Doxorubicin induced heart failure: Phenotype and molecular mechanisms. Int J Cardiol Heart Vasc. 10, 17-24 (2016).
- Aminkeng, F., et al. A coding variant in RARG confers susceptibility to anthracycline-induced cardiotoxicity in childhood cancer. Nat Genet. 47 (9), 1079-1084 (2015).
- Deng, S., et al. Dystrophin-deficiency increases the susceptibility to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Eur J Heart Fail. 9 (10), 986-994 (2007).
- Leong, S. L., Chaiyakunapruk, N., Lee, S. W. Candidate Gene Association Studies of Anthracycline-induced Cardiotoxicity: A Systematic Review and Meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 39 (2017).
- Wasielewski, M., et al. Potential genetic predisposition for anthracycline-associated cardiomyopathy in families with dilated cardiomyopathy. Open Heart. 1 (1), e000116 (2014).
- Lebrecht, D., et al. Dexrazoxane prevents doxorubicin-induced long-term cardiotoxicity and protects myocardial mitochondria from genetic and functional lesions in rats. Br J Pharmacol. 151 (6), 771-778 (2007).
- QuanJun, Y., et al. Protective Effects of Dexrazoxane against Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity: A Metabolomic Study. PLoS One. 12 (1), e0169567 (2017).
- Seifert, C. F., Nesser, M. E., Thompson, D. F. Dexrazoxane in the prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Ann Pharmacother. 28 (9), 1063-1072 (1994).
- Adams, J. W., et al. Enhanced Galphaq signaling: a common pathway mediates cardiac hypertrophy and apoptotic heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 10140-10145 (1998).
- Bowles, N. E., Bowles, K. R., Towbin, J. A. The "final common pathway" hypothesis and inherited cardiovascular disease. The role of cytoskeletal proteins in dilated cardiomyopathy. Herz. 25 (3), 168-175 (2000).
- Kroumpouzou, E., et al. Common pathways for primary hypertrophic and dilated cardiomyopathy. Hybrid Hybridomics. 22 (1), 41-45 (2003).
- Towbin, J. A., Bowles, K. R., Bowles, N. E. Etiologies of cardiomyopathy and heart failure. Nat Med. 5 (3), 266-267 (1999).
- Liu, Y., et al. Visnagin protects against doxorubicin-induced cardiomyopathy through modulation of mitochondrial malate dehydrogenase. Sci Transl Med. 6 (266), 266ra170 (2014).
- Asimaki, A., et al. Identification of a new modulator of the intercalated disc in a zebrafish model of arrhythmogenic cardiomyopathy. Sci Transl Med. 6 (240), 240ra274 (2014).
- Ding, Y., et al. Haploinsufficiency of target of rapamycin attenuates cardiomyopathies in adult zebrafish. Circ Res. 109 (6), 658-669 (2011).
- Sun, X., et al. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4 (8), e6596 (2009).
- Sun, Y., et al. Activation of the Nkx2.5-Calr-p53 signaling pathway by hyperglycemia induces cardiac remodeling and dysfunction in adult zebrafish. Dis Model Mech. 10 (10), 1217-1227 (2017).
- Yang, J., Shah, S., Olson, T. M., Xu, X. Modeling GATAD1-Associated Dilated Cardiomyopathy in Adult Zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (1), (2016).
- Ding, Y., et al. Trapping cardiac recessive mutants via expression-based insertional mutagenesis screening. Circ Res. 112 (4), 606-617 (2013).
- Ding, Y., et al. A modifier screen identifies DNAJB6 as a cardiomyopathy susceptibility gene. JCI Insight. 2 (8), (2017).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), (2010).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Dis Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).
- Desai, V. G., et al. Development of doxorubicin-induced chronic cardiotoxicity in the B6C3F1 mouse model. Toxicol Appl Pharmacol. 266 (1), 109-121 (2013).
- Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Pediatr Res. 64 (5), 488-494 (2008).
- Chatterjee, K., Zhang, J., Honbo, N., Karliner, J. S. Doxorubicin cardiomyopathy. Cardiology. 115 (2), 155-162 (2010).
- Bang, C., et al. Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy. J Clin Invest. 124 (5), 2136-2146 (2014).
- Rassaf, T., Kelm, M. Protection from diabetic cardiomyopathy – putative role of the retinoid receptor-mediated signaling. J Mol Cell Cardiol. 59, 179-180 (2013).
- Wahbi, K., et al. Dilated cardiomyopathy in patients with mutations in anoctamin 5. Int J Cardiol. 168 (1), 76-79 (2013).
- Zhou, M. D., Sucov, H. M., Evans, R. M., Chien, K. R. Retinoid-dependent pathways suppress myocardial cell hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7391-7395 (1995).
- Hershman, D. L., et al. Doxorubicin, cardiac risk factors, and cardiac toxicity in elderly patients with diffuse B-cell non-Hodgkin’s lymphoma. J Clin Oncol. 26 (19), 3159-3165 (2008).
- Silber, J. H., Barber, G. Doxorubicin-induced cardiotoxicity. N Engl J Med. 333 (20), 1359-1360 (1995).
- Von Hoff, D. D., et al. Risk factors for doxorubicin-induced congestive heart failure. Ann Intern Med. 91 (5), 710-717 (1979).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), (2009).
- Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish. Zebrafish. 8 (4), 203-210 (2011).
- Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging adult zebrafish. J Vis Exp. (78), (2013).
