Um modelo de cardiomiopatia induzida por doxorrubicina no Zebrafish adulto
Summary
Um método para gerar um modelo de cardiomiopatia induzida pela doxorrubicina em adulto peixe-zebra (Danio rerio) é descrito aqui. Apresentam-se duas formas alternativas de injeção intraperitoneal e condições para reduzir as variações entre diferentes grupos experimentais são discutidas.
Abstract
O geneticamente acessível adulto peixe-zebra (Danio rerio) tem sido cada vez mais usado como um modelo de vertebrados para a compreensão de doenças humanas, tais como cardiomiopatia. Devido à sua conveniência e acessibilidade para manipulações genéticas de alta produtividade, a geração de modelos de cardiomiopatia adquirida, como o modelo de cardiomiopatia induzida por doxorrubicina (DIC) no zebrafish adulto, está abrindo as portas para novos caminhos de pesquisa, inclusive descobrindo modificadores de cardiomiopatia através de rastreamento genético para a frente. Diferente do modelo embrionário zebrafish DIC, tanto inicial aguda e posteriormente crônicas fases de cardiomiopatia podem ser determinadas no modelo adulto zebrafish DIC, permitindo o estudo dos mecanismos de sinalização dependente de palco e estratégias terapêuticas. No entanto, a variáveis resultados podem ser obtidos com o modelo atual, mesmo nas mãos de investigadores experientes. Para facilitar a futura implementação do modelo de DIC, apresentamos um protocolo detalhado sobre como gerar este modelo DIC no zebrafish adulto e descrever duas maneiras alternativas de injeção intraperitoneal (IP). Vamos voltar a discutir opções sobre como reduzir variações para obter resultados fiáveis e fornece sugestões sobre como interpretar adequadamente os resultados.
Introduction
Doxorrubicina (DOX), também chamada Adriamicina, foi desenvolvida como uma droga anti-neoplásicos desde a década de 1960,1,2. Agora é ainda ativamente utilizado como uma droga de quimioterápico importante para um amplo espectro de tumores. No entanto, aplicação clínica da DOX foi prejudicada por sua toxicidade dose-dependente, especialmente a cardiotoxicidade caracterizada por sintomas variáveis, variando de alterações eletrocardiográficas assintomáticas a pericardite e descompensada cardiomiopatia 1 , 2. até à data, pelo menos, três grandes hipóteses têm sido levantadas para explicar a DIC, incluindo registrados reativas de oxigênio (ROS) de espécies1,3,4,5, inibição da topoisomerase II-β ( TOP2β)6,7e modulação de cálcio intracelular release1,8,9. Acumular evidência também sugere predisposição genética como fator de risco importante para DIC10,11,12,13. Identidades de gene relacionado com estas predisposições DIC, no entanto, permanecem em grande parte desconhecidos. Dexrazoxane é o único agente adjuvante aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) para tratar o DIC, mas com aplicação limitada14,15,16, ressaltando a necessidade de identificar adicionais estratégias terapêuticas. Modelos animais de DIC, portanto, são explorados para estes fins. Devido à sua acessibilidade e simplicidade, mecanicistas estudos sobre modelos DIC potencialmente poderiam ter impactos mais amplos em outros tipos de cardiomiopatias: patogênese comum pode ser compartilhado entre cardiomiopatias de diferentes etiologias, especialmente à tarde estágios patológicos17,18,19,20.
Além de modelos de roedores de DIC, modelos DIC zebrafish com uma taxa de transferência foram desenvolvidos para facilitar a descoberta de novos fatores genéticos e terapêutica. Um modelo DIC embrionário foi estabelecido nos embriões de peixe-zebra transparente para a seleção de compostos terapêuticos21. Dado que as miocardiopatias são doenças de início adulto com uma patogênese progressiva, cardiomiopatia zebrafish adulto modelos têm sido desenvolvidos22,23,24,25,26. Geramos o primeiro modelo adquirido para cardiomiopatia resultante da anemia crônica24, seguido por DIC como o segundo modelo de cardiomiopatia adquirida no zebrafish adultos23. Nós achamos que a injeção de um único bolus de DOX em zebrafish adulto induz cardiotoxicidade que consiste de uma fase aguda, mais ou menos dentro de injeção de pós de 1 semana (wpi), seguida por uma fase crônica de cardiomiopatia de injeção após 6 meses. Enquanto haploinsuficiência do alvo da rapamicina mecanicista(mtor) melhora a cardiomiopatia na fase crônica, ele exagera peixe mortalidade na fase aguda, ressaltando o valor do modelo adulto DIC para discernir a fase dependente mecanismos de23. Mais demonstrámos que o modelo DIC adulto pode ser usado para salientar uma coleção de zebrafish insercional cardíaca (ZIC) mutantes que estão sendo gerados através de uma abordagem de mutagênese insercional baseados em transposon27. Uma tela piloto identificado 3 genes de cardiomiopatia conhecida bem como DnaJ (Hsp40) homólogo, subfamília B e membro 6b (dnajb6b) como novo DIC genes de suscetibilidade28. Portanto, a geração do modelo adulto DIC no zebrafish levou a uma nova metodologia que permite a identificação de modificadores genéticos para DIC, que complementa o estudo de associação de genoma-largo existente (GWAS) e locus traço quantitativos (QTL sistematicamente ) análise.
Durante a geração e implementação do modelo adulto zebrafish DIC, notamos variações significativas entre os diferentes pesquisadores e/ou mesmo entre diferentes injecções realizadas pelo mesmo investigador. A natureza longitudinal do modelo impõe desafios para registrar os resultados de diferentes investigadores e ao processo de solução de problemas sequencial. Para facilitar o uso desse método simples stress induzindo cardiomiopatia pela comunidade de pesquisa, descrevemos nosso protocolo detalhadamente, presentes dois tipos de injeção do IP e discutir considerações para reduzir as variações entre diferentes pesquisadores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para modelar uma DIC progressiva, a dose de 20 mg/kg DOX foi determinada experimentalmente como a dose mais elevada que não causa morte de peixes significativo durante 1 wpi mas ainda resultados na morte de peixes e a redução da função cardíaca após 4 wpi (Figura 3 e Figura 4). Esta dose é comparável aos frequentemente usados em modelos de roedores DIC (15-25 mg/kg) e para a dose cumulativa de limite em humanos (550 mg/m2, que é equivalente…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado em parte por uma concessão de desenvolvimento cientista da associação americana do coração (14SDG18160021 para YD), o US NIH R01 concede HL 81753 e HL 107304 para XX e a Fundação de Mayo para XX.
Materials
| Crossing tank | Aquaneering | ZHCT100 | Fish breeding |
| Incubator | ThermoFisher | Maintaining embryo | |
| 3 L medium tank | Aquaneering | ZT280 | Maintaining fish |
| Paramecia | Carolina | 131560 | Food for juvenile fish |
| Live hatched brine shrimp | in house | Food for adult fish | |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | |
| 1.5 ml safe-lock tube | Eppendorf | No. 022363204 | For drug storage |
| Aluminum foil paper | Fisher | 1213104 | For preventing light exposure |
| Proteinase K | Roche | No. 03115887001 | For dechorionating embryo |
| Hank's balanced salt solution (HBBS) | ThermoFisher | 14025076 | Vehicle for DOX |
| 100 mm petri dish | Falcon | 431741 | |
| 10 μL NanoFil micro-syringe | WPI | NANOFIL | For injection |
| 34 gauge needle | WPI | NF34BV-2 | For injection |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthetizing fish |
| 96 well plate | Costar | 3539 | For embryo drug treatment |
| Transfer pipette | Bel-art product | F37898 | For transfering embryo |
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