大人のゼブラフィッシュのドキソルビシン誘発心筋症モデル
Summary
アダルト ゼブラフィッシュ (動脈分布) のドキソルビシン誘発心筋症モデルを生成する方法を次に紹介します。腹腔内投与の 2 つの方法を提示し、さまざまな実験グループのばらつきを減らすための条件について説明。
Abstract
遺伝的にアクセスできるアダルト ゼブラフィッシュ (動脈分布) は、心筋症などの疾患を理解するため脊椎動物モデルとしてますます使用されています。利便性、こうしてハイスループット遺伝子操作のため取得した心筋症モデルの生成アダルト ゼブラフィッシュのドキソルビシン誘発心筋症 (DIC) モデルなどは扉を開いて、新しい研究手段に前方遺伝学的スクリーニングを介して心筋症修飾子の発見を含みます。ゼブラフィッシュ胚の DIC モデルとは異なり、急性初期と後で慢性期心筋症決定できますアダルト ゼブラフィッシュ DIC モデルでは、ステージ依存性シグナル伝達機構と治療戦略の研究を有効にします。ただし、現在のモデルでは、経験豊富な研究者の手にも変数の結果を取得できます。DIC モデルの将来の実装を容易にするには、大人のゼブラフィッシュのこの DIC モデルを生成および腹腔内 (IP) 投与の 2 つの代替方法について説明する方法で詳細なプロトコルを紹介します。我々 はさらに信頼性の高い結果を取得し、結果を適切に解釈する方法に関する提案を提供する変化を少なくための方法について説明します。
Introduction
1960 年代1,2以来抗腫瘍薬として開発されたドキソルビシン (DOX)、アドリアマイシンとも呼ばれます。それが今はまだ腫瘍の広範なスペクトルの重要な化学療法薬として積極的に使用します。しかし、DOX の臨床応用は、その用量毒性によって妨げられた、心毒性特に無症候性の心電図変化から心膜炎に至るまで可変の症状によって特徴づけられる、心筋症の時1,2活性酸素種 (ROS)1,3,4、5、トポイソメラーゼ II β (の抑制を含む DIC を説明するまでに、少なくとも 3 つの主要な仮説を提起されている。TOP2β)6、7、および細胞内カルシウムの変調は、1,8,9をリリースします。また DIC10、11,12,13の極めて重要なリスク因子として遺伝的素因を示唆証拠の蓄積します。しかしこれらの DIC の素因に関連する遺伝子のアイデンティティ、主不明のまま。Dexrazoxane は追加を識別する必要性を強調、唯一のアジュバント エージェント、DIC の治療に米国食品医薬品局 (FDA) が限定的に実施14,15,16, 承認治療戦略。DIC の動物モデルはこれらの目的のため検討されます。そのアクセシビリティとシンプルさに、DIC モデルの解明いる可能性のある広範な影響心筋症の他の種類の: 一般的な病因共有可能性があります別の病因による心筋症の中で特に後病理学的ステージ17,18,19,20。
DIC の齧歯動物モデルに加えてより高いスループットのゼブラフィッシュ DIC モデルは新しい遺伝的要因と治療法の探索を容易にするために発達しました。21治療化合物をスクリーニングするための透明の zebrafish の胚の胚の DIC モデルを設置します。心筋症には、進歩的な病因と成人発症疾患がされますが、モデルがされている大人のゼブラフィッシュ心筋症は22,23,24,25,26を開発しました。我々 は、心筋症による慢性貧血24、続いて DIC アダルト ゼブラフィッシュ232 番目の取得した心筋症モデルとしての最初の獲得モデルを生成されます。アダルト ゼブラフィッシュに DOX の単一ボーラス注入が続いて心筋症の慢性期 6 ヶ月投与後に投与後 1 週間 (wpi) 内ほぼ急性期から成る心毒性を誘導することがわかった。ラパマイシンの機構のターゲットのハプロ不全により中(mtor) 心筋症の改善も慢性の段階でそれは誇張魚死亡率急性期でステージ依存を識別する大人の DIC モデルの値を強調します。機構23。我々 はさらに大人の DIC モデルを挿入変異のトランスポゾン ベース アプローチ27経由で生成されているゼブラフィッシュ挿入の心臓 (ジック) 変異のコレクションを強調する使用ことができることを実証しました。パイロット画面識別 DnaJ (Hsp40) の相同物、亜科 B、およびメンバーの 6 b と同様に、3 の知られている心筋症遺伝子 (dnajb6b) として新しい DIC 感受性遺伝子28。したがって、ゼブラフィッシュの大人の DIC モデルの生成は、体系的に DIC は、既存のゲノム広い連合の調査 (GWAS) と量的形質遺伝子座 (QTL を補完の遺伝的修飾因子の同定を可能にする新しい方法論につながった) 分析。
世代と成人ゼブラフィッシュ DIC モデルの実装は、我々 は別の研究者の間でおよび/または同じ調査官によって実行される別の注射の中でも大きな変化に気づいた。モデルの縦の性質は、別の捜査官からの結果を登録して、連続するトラブルシューティング プロセスに課題を課しています。この単純な心筋症を誘発するストレスによる研究コミュニティの使用を容易にするには、我々 のプロトコルの詳細、IP 注入の存在の 2 つのタイプと異なる研究者のばらつきを減らすための考慮事項について説明.
Protocol
Representative Results
Discussion
進歩的な DIC をモデルに DOX の 20 の mg/kg の線量だった魚の死の 1 の wpi がまだ結果の間に重要な魚の死と 4 wpi (図 3および後心機能の低下が発生しない最高の線量として実験的に決定図 4)。この線量はこれらの齧歯動物の DIC モデル (15 〜 25 mg/kg) で頻繁に使用して人間 (550 mg/m2、15 mg/kg に相当) の限界累積投与量に匹敵する4…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、アメリカの中心連合からの科学者の開発補助金による部分で支えられました (YD に 14SDG18160021)、米国 NIH R01 付与 HL 81753 と HL 107304 xx、XX にメイヨー財団。
Materials
| Crossing tank | Aquaneering | ZHCT100 | Fish breeding |
| Incubator | ThermoFisher | Maintaining embryo | |
| 3 L medium tank | Aquaneering | ZT280 | Maintaining fish |
| Paramecia | Carolina | 131560 | Food for juvenile fish |
| Live hatched brine shrimp | in house | Food for adult fish | |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | |
| 1.5 ml safe-lock tube | Eppendorf | No. 022363204 | For drug storage |
| Aluminum foil paper | Fisher | 1213104 | For preventing light exposure |
| Proteinase K | Roche | No. 03115887001 | For dechorionating embryo |
| Hank's balanced salt solution (HBBS) | ThermoFisher | 14025076 | Vehicle for DOX |
| 100 mm petri dish | Falcon | 431741 | |
| 10 μL NanoFil micro-syringe | WPI | NANOFIL | For injection |
| 34 gauge needle | WPI | NF34BV-2 | For injection |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthetizing fish |
| 96 well plate | Costar | 3539 | For embryo drug treatment |
| Transfer pipette | Bel-art product | F37898 | For transfering embryo |
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