Rétiniennes Cryo-sections, ensemble-montages et préparations hypotonique vaisseaux isolés pour la visualisation d’Immunohistochemical des péricytes microvasculaire
Summary
Nous montrons trois techniques de préparation de tissus différents pour la visualisation d’immunohistochemical des péricytes microvasculaire rétine de rat, c’est-à-dire, cryo-sections, ensemble-montages et hypotonique isolement du réseau vasculaire.
Abstract
Les péricytes rétiniennes jouent un rôle important dans de nombreuses maladies de le œil. IMMUNOHISTOCHEMICAL souillant techniques des vaisseaux rétiniens et microvasculaire péricytes sont au cœur de la recherche ophtalmologique. Il est essentiel de choisir la méthode appropriée de visualiser les péricytes microvasculaires. Nous décrivons rétinienne pericyte microvasculaire immunohistochemical souillant en cryo-sections, ensemble-montages et hypotonique vascularisation isolée en utilisant des anticorps pour β de récepteur de facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRβ) et nerf/glial antigène 2 (NG2). Cela nous permet de mettre en évidence les avantages et les inconvénients de chacune de la préparation de trois tissus de la visualisation de la rétine péricytes microvasculaire. Cryo-sections fournissent transsectional visualisation de toutes les couches rétiniennes mais contiennent seulement quelques coupes transversales occasionnels de la microcirculation. Entier-Montez donne un aperçu de la vascularisation rétinienne ensemble, mais visualisation de la microcirculation peut être gênante. Hypotonique isolement fournit une méthode pour visualiser la vascularisation rétinienne toute en enlevant les cellules neuronales, mais ce qui rend le tissu très fragile.
Introduction
Les péricytes rétiniennes font l’objet de nombreux laboratoires de recherche que ces cellules jouent un rôle majeur dans l’intégrité du système vasculaire. Certaines pathologies telles que la rétinopathie diabétique1, ischémie2et glaucome3 ont des caractéristiques vasculaires qui impliquent la fonction des péricytes. Péricytes sont trouvent dans les plexus capillaires rétiniens intérieures. L’artère rétinienne centrale qui alimente la rétine interne se ramifie en deux couches de plexus capillaires. Le lit vasculaire interne est situé entre les cellules de ganglion et les couches nucléaires internes. La couche plus profonde est plus dense et complexe et est localisée entre les couches nucléaires intérieure et extérieure4,5. En outre, certaines parties de la rétine contiennent également un troisième réseau appelé capillaires parapapillary radial. Celles-ci sont longues, droites capillaires qui se trouvent parmi les fibres nerveuses et rarement s’anastomosent avec les uns ou les autres deux plexus6. Intérieur de la paroi capillaire, péricytes sont incorporées dans la membrane basale et le côté abluminal des cellules endothéliales vasculaires.
À ce jour, il n’y a aucun marqueur biologique unique de ces péricytes qui peut les différencier des autres cellules vasculaires. Β de récepteur de facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRβ) et nerf/glial antigène 2 (NG2) sont des marqueurs couramment utilisés qui sont tous deux présent sur les péricytes mais aussi d’autres cellules vasculaires. Identification des péricytes est encore compliquée par l’existence de sous-ensembles pericyte qui varient dans la morphologie et la protéine expression7. Actuellement, la meilleure identification s’appuie sur une combinaison de marqueurs protéiques et le positionnement caractéristique de la pericyte dans la paroi vasculaire. Nous démontrons ici trois techniques de préparation de tissus différents pour le marquage de PDGFRβ/NG2 immunohistochimique des péricytes microvasculaire rétine de rat, c’est-à-dire, cryo-sections, ensemble-montages et hypotonique isolement du réseau vasculaire.
Cryo-sections, la rétine et la sclérotique sont coupés par l’intermédiaire du nerf optique. Cela permet la visualisation de toutes les structures en couches de neurones. Les dix couches distinctes de la rétine sont apparentes en interchangeant les structures nucléaires et axonale/dendritiques qui peuvent être visualisées avec des taches comme l’hématoxyline/éosine ou fluorescence nucléaire 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)8. Les besoins métaboliques diffèrent entre les couches9 et il fournit une méthode pour déterminer l’absence de total ou de l’épaisseur d’une couche spécifique (par exemple, la perte de cellules ganglionnaires rétiniennes est l’une des caractéristiques de l’ischémie rétinienne10, 11). La vascularisation est évidente puisque transverse traverse la rétine, ce qui permet d’étudier séparément les plexus capillaires dans les couches rétiniennes respectifs12,13.
Plus traditionnellement, les enquêtes du réseau vasculaire rétinienne sont effectuées dans son ensemble-montures rétiniennes. Avec cette préparation du tissu, la rétine est coupée et aplatie comme une structure en forme de fleur. La méthode est une technique de préparation de tissus relativement rapide qui peut mettre en évidence la vascularisation rétinienne d’architecture globale et il est donc souvent appliqué lors de l’enquête de la néovascularisation dans la rétine murine. Visualisation réussie de la microcirculation dans les rétines montés ensemble est également signalée dans le développement néonatale souris et rat rétine14,15,16,17,18, 19. ces études révèlent une activité pericytic plus définie avec les plus grandes zones exemptes de capillaire chez l’adulte par rapport à la rétine néonatale14.
Une autre façon de visualiser est la microcirculation rétinienne après isolement hypotonique. Cette technique de préparation de tissus se traduit par des vaisseaux sanguins rétiniens et capillaires libérées des cellules neuronales. Ce type d’imagerie bidimensionnelle du réseau vasculaire rétiniens isolé est généralement effectué après digestion de trypsine rétinienne20 et utilisé pour évaluer les anomalies vasculaires de la rétinopathie diabétique, y compris perte de pericyte et des capillaires dégénérescence20,21,22. La méthode d’isolement hypotonique propose des enquêtes du gène vasculaire rétinienne et réponses réglementaires de protéine comme il a été fait avec la RT-PCR et western blot23,24,25. Ici, nous fournissons un protocole pour la coloration immunohistochimique flottant de la vascularisation rétinienne isolée hypotonique comme alternative à la digestion trypsique d’examiner les péricytes microvasculaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons trois techniques de préparation rétinienne qui peuvent être appliquées dans l’étude des péricytes rétinienne microvasculaires. Ci-dessous, nous permettre une comparaison entre chacune des méthodes et les mettre en évidence des étapes cruciales dans les protocoles.
Avec cryo-sectionnement, la rétine est découpée en coupes sagittales et donc, il est possible d’obtenir de nombreux spécimens de la rétine même. Les sections chiffres résultant de cette méthode …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche a été financée par la Fondation de Lundbeck, Danemark.
Materials
| Geletin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
| Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | Dissolved in 0.15 M NaCl |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121, lot 129348 | |
| Rabbit anti-PDGFRβ | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
| Mouse anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
| Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dissolved in DMSO |
| Anti-fading mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Anti-fading mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 |
Referenzen
- Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. Diabetic retinopathy: Breaking the barrier. Pathophysiology. , (2017).
- Cai, W., et al. Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke. Translational Stroke Research. , (2016).
- Trost, A., et al. Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).
- Ramos, D., Lagali, N., et al. The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels. Confocal Laser Microscopy – Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. , (2013).
- Moran, E. P., et al. Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).
- Henkind, P. Microcirculation of the peripapillary retina. Transactions – American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O’Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte?. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, 451-455 (2016).
- Fernandez-Bueno, I., et al. Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).
- Yu, D. -. Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -. N. Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature. Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).
- Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
- Kyhn, M. V., et al. Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation. Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).
- Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina. Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).
- Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).
- Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents. Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).
- Park, D. Y., et al. Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier. Nature Communications. 8, 15296 (2017).
- Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).
- Lange, C., et al. Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice. Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).
- Higgins, R. D., et al. Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy. Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).
- Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).
- Hazra, S., et al. Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes. Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).
- Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon. Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes. Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).
- Gustavsson, C., et al. Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia. PLoS One. 5, e12699 (2010).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).
