망막 Cryo-섹션, Microvascular Pericytes의 Immunohistochemical 시각화에 대 한 전체-마운트 및 소형 고립 된 맥 관 구조

Summary

쥐 망막 microvascular pericytes, 즉, cryo 섹션, 전체 마운트 및 혈관 네트워크의 침투성 절연의 immunohistochemical 시각화를 위한 3 개의 다른 조직 준비 기술을 설명합니다.

Abstract

망막 pericytes 눈의 많은 질병에 중요 한 역할을 한다. 얼룩 기법 및 microvascular 망막 혈관의 Immunohistochemical pericytes는 안 과학 연구의 중심. Microvascular pericytes를 시각화 하는 적절 한 방법을 선택 하는 것이 생명 이다. 곳을 알아내는-섹션, 전체 마운트, 그리고 혈소판 유래 성장 인자 수용 체 β (PDGFRβ)와 신경/glial 원 2 (NG2)에 대 한 항 체를 사용 하 여 소형 고립 된 맥 관 구조에 얼룩 망막 microvascular pericyte immunohistochemical을 설명 합니다. 장점과 망막 microvascular pericytes의 시각화에 대 한 세 가지 조직 준비의 각각의 단점을 강조 하기 위해 수 있습니다. 곳을 알아내는-섹션 모든 망막 층의 transsectional 시각화를 제공 하지만 단지 몇 가끔 가로의 상처는 microvasculature 포함. 전체-마운트 전체 망막 맥 관 구조에 대 한 개요를 제공 하지만 시각화는 microvasculature의 곤란 하실 수 있습니다. 침투성 격리 신경 세포의 제거로 전체 망막 맥 관 구조를 시각화 하는 방법을 제공 하지만이 조직 매우 깨지기 쉬운.

Introduction

이 세포는 맥 관 구조의 무결성에 중요 한 역할으로 망막 pericytes 많은 연구 실험실의 초점입니다. 당뇨병 성 망막 증¹, 허 혈², 녹 내장³ 등 병 적인 조건 pericytes의 기능을 포함 하는 혈관 특성이 있다. Pericytes는 내부 망막 모 세관 plexuses에서 발견 된다. 중앙 망막 동맥 내부 망막을 공급 하는 모 세관 plexuses의 2 개의 층으로 분기 한다. 내부 관 침대는 신경 절 세포와 안 핵 층 사이 위치 해 있습니다. 깊은 계층 더 조밀 하 고 복잡 한 이며 내부 및 외부 핵 층^4,5사이 지역화 됩니다. 또한, 망막의 일부는 또한 광선 parapapillary 모세 나 세 번째 네트워크를 포함 합니다. 이들은 긴, 신경 섬유 중 고 거의 직선 모 세관 다른 하나 또는 다른 두 plexuses⁶anastomose. 모 세관 벽에서 pericytes 지하실 멤브레인에 포함 하 고 혈관 내 피 세포의 abluminal 사이드 라인.

이 날짜에, 다른 혈관 세포에서 그들을 차별화 수 있는 이러한 pericytes의 독특한 생물 학적 마커 없는 있다. 혈소판 파생 된 성장 인자 수용 체 β (PDGFRβ)와 신경/glial 원 2 (NG2)는 일반적으로 사용 되 마커는 모두 다른 혈관 세포도 하지만 pericytes에 선물. Pericytes의 더 다양 한 형태 및 단백질 식⁷에서 pericyte 하위 집합의 존재에 의해 복잡 합니다. 현재, 최고의 식별 마커 단백질의 조합 및 혈관 벽에서 pericyte의 독특한 위치에 의존 합니다. 여기 쥐 망막 microvascular pericytes, 즉, cryo-섹션, 전체 마운트, 당뇨의 및 절연 혈관 네트워크의 immunohistochemical PDGFRβ/NG2 얼룩에 대 한 세 가지 다른 조직 준비 기술 설명 합니다.

곳을 알아내는-섹션, 망막과 공 막 시 신경을 통해 잘립니다. 신경의 모든 계층 구조의 시각화 수 있습니다. 망막의 고유 10 층 등 되며/오신 형광 핵 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)⁸얼룩으로 구상 될 수 있다 핵 및 axonal/돌기 구조를 교환으로 명백 하다. 레이어⁹ 와 그것은 신진 대사 요구 사항을 다 특정 층의 두께 또는 총 휴무를 결정 하는 방법을 제공 한다 (예를 들어, 망막 신경 절 세포의 손실 이다 망막 허 혈^{10의 특징 중 하나 11}). 맥 관 구조 가로 각각 망막 층^12,13내의 모 세관 plexuses를 별도로 공부 하는 게 가능 하 망막을 통해 삭감으로 분명 하다.

더 전통적으로, 망막 맥 관 구조 네트워크의 조사는 망막 전체-마운트에 수행 됩니다. 이 조직 준비, 망막은 잘라내어 꽃 모양의 구조로 결합. 메서드는 전체 아키텍처 망막 맥 관 구조를 강조 표시할 수 있습니다 상대적으로 빠른 조직 준비 기술 이며 따라서 neovascularization murine 망막에서의 조사에 적용 종종. 전체 장착 망막에 microvasculature의 성공적인 시각화 또한 개발 신생아 마우스와 쥐 망막^{14,15,,1617,18,} 에서 보고 ¹⁹.이 연구는 신생아 망막¹⁴에 비해 성인에서 더 큰 모 세관 자유로운 지역으로 더 정의 된 pericytic 활동을 공개.

시각화의 또 다른 방법은 소형 격리 후 망막 microvasculature입니다. 이 조직 준비 기술 망막 혈관과 신경 세포의 해제 되 고 모세 혈관에서 발생 합니다. 격리 망막 혈관 네트워크의 2 차원 이미지의이 유형은 일반적으로 망막 트립 신 소화²⁰ 후 수행 하 고 pericyte 손실 및 모 세관을 포함 하 여 당뇨병 성 망막 증의 혈관 이상이 평가 하는 데 사용 변성^20,,2122. 침투성 격리 방법 그들은 RT-PCR와 서쪽 더 럽 히^23,,2425완료 되었습니다 망막 혈관 유전자와 단백질 규제 응답의 조사를 제공 합니다. 여기 검사 microvascular pericytes 트립 신 소화 하는 대신 소형 고립 된 망막 맥 관 구조의 무료-플 로트 immunohistochemical 얼룩에 대 한 프로토콜을 제공 합니다.

Protocol

프로토콜 최적화 하 고 성인 남성 알 비 노 쥐에 설명 했다. 모든 실험 절차, 동물 ARVO 문에서 규정 안과 및 비전 연구에 있는 동물의 사용에 대 한 치료 했다. 동물은 이산화탄소와 이후 자 궁 경부 전위에 의해 안락사 되었다. 1. 쥐 망막 조직 준비 곳을 알아내는-섹션 메스로 쥐 눈 꺼 풀에 후부 및 이전 ~0.5 cm의 가늘고 길게 찢어진 곳을 확인 합니다…

Representative Results

성공적인 프로토콜 microvascular pericytes를 시각화에 대 한 세 가지 다른 망막 준비를 제공 합니다. 이러한 각 메서드 PDGFRβ 및 NG2 immunoreactivity 공동 지역화와 모 세관 내 피 foridentification 주위에 포장 하는 pericytes의 독특한 위치를 사용 합니다. 곳을 알아내는-섹션, 신경 레이어 DAPI 셔 서 핵과 내부 형광 밀도 의해 확인 될 수 있다?…

Discussion

선물이 microvascular 망막 pericytes의 연구에 적용 될 수 있는 3 개의 망막 준비 기술. 아래, 우리 각 메서드 사이 비교를 제공 하 고 프로토콜에서 중요 한 단계를 강조.

곳을 알아내는-단면, 망막은 잘라 화살 섹션에 따라서, 그것은 동일한 망막에서 수많은 견본을 얻을 수. 이 방법에서 결과 숫자 섹션 항 체 특이성 및 적정 테스트로 불필요 한 동물 희생을 방지 하기 위한 이상적인…

Materials

Geletin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2625-500G
Albumin from chicken egg white	Sigma-Aldrich	A5253-500G
Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	D5025-15KU	Dissolved in 0.15 M NaCl
Bovine serum albumin (BSA)	VWR	0332-100G
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121, lot 129348
Rabbit anti-PDGFRβ	Santa Cruz	sc-432	1:100
Mouse anti-NG2	Abcam	ab50009	1:500
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	711-585-152	1:100
Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-095-151	1:100
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-225-152	1:100
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-165-150	1:100
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Dissolved in DMSO
Anti-fading mounting medium	Vector Laboratories	H-1000
Anti-fading mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide	Thermo Fisher Scientific	154526