Netzhaut Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone isoliert Gefäßsystem Vorbereitungen für immunhistochemische Visualisierung von Mikrovaskulären Perizyten
Summary
Wir führen drei verschiedene Gewebe Vorbereitung Techniken für immunhistochemische Visualisierung der Ratte retinalen mikrovaskuläre perizyten, d. h. Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone Isolierung des vaskulären-Netzes.
Abstract
Netzhaut perizyten spielen eine wichtige Rolle bei vielen Erkrankungen des Auges. Immunhistochemische Färbung Techniken der Netzhautgefäße und mikrovaskuläre prägen perizyten ophthalmologischen Forschung. Es ist wichtig, eine geeignete Methode zur Visualisierung der mikrovaskulären perizyten wählen. Wir beschreiben retinalen mikrovaskuläre Pericyte immunhistochemische Färbung in Cryo-Abschnitte, ganze-Reittiere und hypotone isoliert Gefäßsystem mit Antikörpern für Platelet-derived Wachstumsfaktor-Rezeptor β (PDGFRβ) und Nerven/Glia Antigen 2 (NG2). Dies ermöglicht es uns, vor- und Nachteile jeder der drei Gewebe Vorbereitungen für die Visualisierung von der Netzhaut mikrovaskulären perizyten hervorzuheben. Cryo-Abschnitte enthalten nur ein paar gelegentliche Quere Schnitten von den Microvasculature aber Transsectional Visualisierung aller Schichten der Netzhaut. Ganz-Mount bietet eine Übersicht über die gesamte Netzhaut Gefäßsystem, aber Visualisierung von den Microvasculature kann lästig sein. Hypotone Isolierung bietet eine Methode, um die gesamte Netzhaut Gefäßsystem durch den Abbau von Nervenzellen zu visualisieren, aber das macht das Gewebe sehr zerbrechlich.
Introduction
Netzhaut perizyten stehen im Mittelpunkt von vielen Forschungslabors, wie diese Zellen eine wichtige Rolle in die Integrität des Gefäßsystems spielen. Pathologische Zuständen wie Diabetische Retinopathie1, Ischämie2und Glaukom3 haben vaskuläre Merkmale, die die Funktion der perizyten beinhalten. Perizyten befinden sich in der inneren retinalen Kapillaren Plexi. Der zentralen Netzhautarterie, die die inneren Netzhaut liefert verzweigt sich in zwei Schichten der Kapillare Plexi. Die innere vaskuläre Bett befindet sich zwischen dem Ganglion Zelle und nukleare Innenlagen. Die tiefere Schicht ist dicht und komplex und ist zwischen der inneren und äußeren nuclear Layer4,5lokalisiert. Darüber hinaus enthalten einige Teile der Netzhaut auch eine dritte Netz bezeichnet die radiale Parapapillary Kapillaren. Dies sind lange, gerade Kapillaren, die unter die Nervenfasern und selten liegen anastomosieren mit einander oder die anderen beiden Plexi-6. Innerhalb der Kapillare Wand perizyten sind eingebettet in die Basalmembran und Linie die abluminalen Seite des vaskulären endothelialen Zellen.
Zu diesem Zeitpunkt gibt es keine einzigartige biologische Marker für diese perizyten, die sie von anderen vaskulären Zellen unterscheiden kann. Platelet-derived Wachstumsfaktor-Rezeptor β (PDGFRβ) und Nerven/Glia Antigen 2 (NG2) sind häufig verwendete Markierungen die perizyten aber auch andere vaskulären Zellen zu präsentieren. Identifizierung von perizyten wird weiter erschwert durch das Vorhandensein von Pericyte Teilmengen, deren Morphologie und Protein Ausdruck7variiert. Derzeit setzt die besten Identifizierung auf eine Kombination aus Protein-Marker und die charakteristischen Positionierung des Pericyte in der Gefäßwand. Wir zeigen hier drei verschiedene Gewebe Präparationstechniken für immunhistochemische Färbung PDGFRβ/NG2 Ratte retinalen mikrovaskuläre perizyten, d. h., Cryo-Abschnitte, ganze-Halterungen und hypotone Isolierung des vaskulären-Netzes.
Mit Cryo-Abschnitten werden die Netzhaut und Sklera durch den Sehnerv geschnitten. Dies ermöglicht die Visualisierung aller geschichteten Strukturen von Neuronen. Die deutlichen zehn Schichten der Netzhaut sind offensichtlich als Vertauschung Kern- und axonalen/dendritischen Strukturen, die mit Flecken wie Hämatoxylin/Eosin oder fluoreszierende nuklearen 4′, 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)8visualisiert werden können. Die metabolischen Anforderungen unterscheiden sich zwischen den Schichten9 und es bietet eine Methode, um festzustellen, das dicke oder insgesamt Fehlen einer bestimmten Ebene (z. B.der Verlust von retinalen Ganglienzellen ist eines der Markenzeichen von retinale Ischämie10, 11). Das Gefäßsystem ist klar, wie quer der Netzhaut durchschneidet, die es ermöglichen, die Kapillare Plexi innerhalb der jeweiligen Netzhaut Schichten12,13separat zu studieren.
Eher traditionell sind die Untersuchungen des retinalen Gefäßsystem Netzwerks in retinalen ganze-Halterungen durchgeführt. Gewebe vorbereitet ist die Netzhaut schneiden und flach wie eine Blume-förmige Struktur. Die Methode ist eine relativ schnelle Gewebe Präparationstechnik, die das gesamte Architektur retinalen Gefäßsystem hervorheben kann und es wird daher oft in der Untersuchung der Neovaskularisation in der murinen Netzhaut angewendet. Erfolgreiche Visualisierung von Microvasculature im gesamten montierte Netzhaut wird auch in die Entwicklung Neugeborener Maus und Ratte Netzhaut14,15,16,17,18, berichtet. 19. diese Studien zeigen eine definierte Pericytic-Aktivität mit größeren Kapillar-freie Flächen bei Erwachsenen im Vergleich zu den Neugeborenen Netzhaut14.
Eine weitere Möglichkeit der Visualisierung ist die Netzhaut Microvasculature nach hypotone Isolierung. Dieses Gewebe Präparationstechnik führt Netzhautgefäße und Kapillaren der neuronalen Zellen freigegeben wird. Diese Art von zweidimensionalen Bildgebung des retinalen Gefäße inselnetzes ist in der Regel nach retinalen Trypsin Verdauung20 durchgeführt und zur Beurteilung der vaskulären Anomalien der diabetischen Retinopathie einschließlich Pericyte Verlust und Kapillare Degeneration20,21,22. Die hypotone Isolationsmethode bietet die Untersuchungen der retinalen Gefäße gen und Protein regulatorischen Reaktionen mit RT-PCR und westlichen befleckenden23,24,25getan wurde. Wir bieten hier ein Protokoll für die free-Float-immunhistochemische Färbung des das hypotone isoliert retinalen Gefäßsystem als Alternative zu Trypsin-Verdauung, mikrovaskulären perizyten zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir präsentieren Ihnen drei retinalen Vorbereitung Techniken, die in der Studie von mikrovaskulären retinalen perizyten angewendet werden können. Unten, wir bieten einen Vergleich zwischen den einzelnen Methoden und wichtige Schritte in den Protokollen zu markieren.
Mit Cryo-Schnitt, die Netzhaut ist in sagittaler Abschnitte geschnitten und daher ist es möglich, zahlreiche Exemplare von der gleichen Netzhaut zu erhalten. Die Bezugszeichen Abschnitte aus dieser Methode machen es ideal für …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschung wurde finanziert durch die Lundbeck Foundation, Dänemark.
Materials
| Geletin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
| Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | Dissolved in 0.15 M NaCl |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121, lot 129348 | |
| Rabbit anti-PDGFRβ | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
| Mouse anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
| Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dissolved in DMSO |
| Anti-fading mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Anti-fading mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 |
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