Prüfende Zelle Mechanik mit Wulst-freie optische Pinzetten in Drosophila Embryos
Summary
Wir präsentieren Ihnen eine Setup der optischen Pinzette gekoppelt mit einem leichten Bogen Mikroskop und deren Umsetzung, Zelle Mechanik ohne Perlen in Drosophila Embryos zu erforschen.
Abstract
Morphogenese erfordert Koordination zwischen genetischen Musterung und mechanische Kräfte, die Zellen und Gewebe robust zu gestalten. Daher ist eine Herausforderung, morphogenetischen Prozesse verstehen zellulären Kräfte und mechanische Eigenschaften in Vivo in der Embryogenese direkt zu messen. Hier präsentieren wir eine Einrichtung der optischen Pinzette gekoppelt an ein leichtes Blatt-Mikroskop, wodurch Kräfte direkt auf Zell-Zell-Kontakte des frühen Embryos von Drosophila anzuwenden, während der Bildgebung mit einer Geschwindigkeit von mehreren Bildern pro Sekunde. Diese Technik hat den Vorteil, den es nicht erfordert, dass die Injektion von Perlen in den Embryo, normalerweise verwendet als Zwischenprodukt Sonden auf die optischen Kräfte ausgeübt werden. Wir ausführlich Schritt für Schritt die Umsetzung des Setups und Werkzeuge, um mechanische Informationsextraktion aus den Experimenten vorschlagen. Durch die Überwachung der Verschiebungen von Zell-Zell-Kontakten in Echtzeit, kann eine Spannung Messungen durchführen und Zellkontakte Rheologie untersuchen.
Introduction
Embryonalentwicklung ist ein hoch reproduzierbarer Prozess, bei dem die Zellen und Gewebe verformen um das zukünftige Tier zu gestalten. Solche Verformungen haben gezeigt, dass erfordern die aktive Generation der Kräfte an der Zelle Level1,2. Um morphogenetischen Prozesse zu verstehen, während die Zellen und Gewebe ihre Form zu verändern, ist es daher Schlüssel für die mechanischen Eigenschaften der beteiligten Zellen beurteilen und messen die Kräfte innerhalb des Gewebes während der Prozess3,4 . Epitheliale Schichten, vor allem in Drosophila, wurden weitgehend durch ihre quasi-2D-Geometrie und ihre einfache Handhabung untersucht.
Eine Reihe von Techniken wurden so von uns und anderen epithelialen Mechanik in Vivo während der Entwicklung zu bewerten. Wir geben einen schnellen Überblick über die drei wichtigsten Techniken in epithelialen Geweben verwendet. Laser-Ablation, eine weit verbreitete Methode erlaubt es, die lokale mechanische Beanspruchung in der Zelle Kreuzungen5,6,7,8 oder im größeren Maßstab9,10,11 zeigen durch die Durchführung lokaler Kürzungen, die die mechanische Integrität des Ziels zu stören. Die Dynamik der Öffnung nach dem Schnitt informiert der Stress vor Ablation, sowohl auf die Rheologie der Gewebe12,13. Ein Nachteil der Laser-Ablation ist, dass es invasiv, wie es die lokale Störung des Kortex Zelle erfordert. Daher kann man nur eine begrenzte Anzahl von Ablationen durchführen, will man Gewebe Integrität zu bewahren. Ein weiterer Nachteil ist, dass Ablationen nur relative Schätzungen der Spannung am Zellkontakte, da die Öffnung Geschwindigkeit viskose Reibung abhängig ist, die nicht allgemein bekannt ist. Magnetische Manipulation hat auch entwickelt und in Drosophila, an denen entweder die Verwendung von Ferrofluide14 oder ultramagnetic Liposomen15verwendet. Sie bieten absoluten Messungen16,17, sondern sind auch in dem Sinne, dass sie die Injektion von Sonden an der gewünschten Stelle erfordern invasiv. Dies kann je nach System, sehr schwierig sein die nicht immer präzise Injektionen zugänglich ist. Ein drittes Verfahren, völlig nicht-invasiv, ist Kraft Inferenz18,19,20. Kraft Ableitung beruht auf der Annahme des mechanischen Gleichgewichts auf dreifache Punkte (Tricellular Kreuzungen oder Scheitelpunkte) und ermöglicht es, Spannungen überhaupt ableiten, Zell-Zell Kontakte (und gegebenenfalls Druck in allen Zellen) durch ein inverses Problem zu lösen. Für Spannungen bietet jeder Vertex zwei Gleichungen (X und Y). Daraus ergibt sich ein großes System von linearen Gleichungen, die unter bestimmten Bedingungen zur Spannung bei allen Zellkontakte Bewertung invertiert werden kann. Während diese Methode sehr attraktiv, da es nur eine segmentierte Bild und keine zusätzliche Experiment oder Setup erfordert, seine Genauigkeit ist noch zu bestimmen, und wieder es bietet nur relative Werte, wenn eine absolute Kalibrierung-Messung durchgeführt wird.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, stellen wir in diesem Artikel eine Setup der optischen Pinzette gekoppelt an ein leichtes Blatt Mikroskop, kontrollierten Kräfte auf der Ebene der Zelle in der embryonalen Epithel von Drosophila Melanogasteranzuwenden. Optische Pinzette wurden für zahlreiche Anwendungen in der Biologie auch die Messungen auf einzelne Proteine und Manipulation von Organellen und Zellen21verwendet. Wir berichten hier angewendeten Kräfte im Bereich von ein paar Dutzend pN, die kleine ist noch ausreichend, um lokale Verformungen der Zellkontakte zu induzieren und mechanische Messungen in Vivodurchzuführen. In der Regel verwenden wir senkrecht Auslenkung des Zellkontakte, überwacht durch die Analyse der Kymographs, um Kraft auf Verformung zu beziehen. Wichtig ist, erfordert unser Setup nicht die Injektion von Perlen an der gewünschten Stelle im Gewebe, wie optische Pinzette Kräfte auf Zell-Zell-Kontakte direkt ausüben kann. Die Kopplung der optischen Pinzette zu einem leichten Bogen Mikroskop ermöglicht eine schnelle Bildgebung (mehrere Bilder pro Sekunde), was sehr spürbare für eine mechanische Analyse auf kurzen Zeitskalen und mit reduzierten Phototoxizität, da die Beleuchtung von der Probe ist auf der Ebene von imaging-22beschränkt.
Insgesamt, optische Pinzette sind eine nicht-invasive Weise kontrollierten Kräfte bei der in-vivo in Drosophila Embryos Zellkontakte anwenden und mechanische Informationsextraktion wie Steifigkeit und Spannung bei Zelle Kontakte23, rheologischen Eigenschaften 24, und Farbverlauf oder Anisotropie der Spannung23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Optische Pinzetten ermöglichen absolute mechanische Messungen direkt in der embryonalen Entwicklung Epithel in eine nicht-invasive Weise durchführen. In diesem Sinne bietet es Vorteile gegenüber anderen Methoden wie Laser-Ablation, die invasive und liefern relative Messungen, magnetische Kräfte, die Injektionen erfordern, oder zwingen Folgerung, die auf starke Annahmen beruht und auch relative Messungen.
Das Protokoll enthält ein paar wichtige Schritte. Erstens, da das Objektiv zeigen kö…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch eine FRM Equipe Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale De La Recherche ANR-Blanc Grant Morfor ANR-11-BSV5-0008 (zur P.-f.l.) unterstützt. Wir erkennen Frankreich BioImaging Infrastruktur unterstützt durch die französische National Research Agency (ANR-10-INBS-04-01, «Investitionen in die Zukunft»). Wir danken Brice Detailleur und Claude Moretti aus der PICSL-FBI-Infrastruktur für technische Hilfe.
Materials
| Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW | IPG Laser | YLM-10-LP-SC | including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser |
| Ø1/2" Optical Beam Shutter | Thorlabs | SH05 | |
| Small Beam Diameter Galvanometer Systems | Thorlabs | GVS001 | 1 for X displacement, 1 for Y displacement |
| 1D or 2D Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | galvanometers power supply |
| 2 lenses f = 30mm | Thorlabs | LB1757-B | relay telescope between 2 galva |
| Lens f = 200mm | Thorlabs | LB1945-B | 2.5X telescope |
| Lens f = 500mm | Thorlabs | LB1869-B | 2.5X telescope |
| Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes | Thorlabs | KCB1E | Periscope |
| Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style | Thorlabs | LG1 | |
| 45° AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror | Edmund Optics | #64-470 | |
| Multiphoton-Emitter HC 750/S | AHF | HC 750/SP | |
| CompactDAQ Chassis | National Instruments | cDAQ-9178 | |
| C Series Voltage Output Module | National Instruments | NI-9263 | Analog output module |
| C Series Voltage Input Module | National Instruments | NI-9215 | Analog input module |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids | ThermoFisher Scientific | F8812 | calibration beads |
| C++ (Qt) home made optical tweezers software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview |
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