초파리 배아에 구슬 없는 광학 핀셋으로 셀 역학 조사
Summary
선물이 빛 시트 현미경을 초파리 태아에 구슬 없이 셀 역학을 구현 결합 광학 족집게의 설치.
Abstract
Morphogenesis 유전 패턴화와 견고 하 게 모양 세포와 조직에 기계적인 힘 사이 협력을 요구 한다. 따라서, 전체적 프로세스를 이해 하는 도전 직접 embryogenesis 동안 세포 세력과 vivo에서 기계적 성질을 측정 하는. 여기, 우리 초기 초파리 배아의 세포-세포 연락처에 군대를 직접 적용할 수 있는 가벼운 시트 현미경을 결합 하는 광학 족집게의 설정을 현재 초당 몇 프레임의 속도로 이미징 동안. 이 기술은 광학 힘 발휘는 중간 조사로 일반적으로 사용 되는 배아에 구슬의 주입을 요구 하지 않는 이점이 있다. 우리는 단계적으로 설치, 구현에 자세히 설명 하 고 실험에서 기계적인 정보를 추출 하는 도구를 제안. 실시간으로 셀 연락처의 변위를 모니터링 함으로써 한 긴장 측정을 수행 하 고 셀 연락처 유동성 조사 수 있습니다.
Introduction
배아 개발 기간 동안 세포와 조직 미래 동물 모양 변형 매우 재현 과정 이다. 같은 개 악 셀 수준1,2에서 세력의 적극적인 세대를 요구 하도록 표시 되었습니다. 세포와 조직 그들의 모양을 변경 하는 전체적 프로세스 이해, 그것은 따라서 키 참여, 세포의 기계적 특성을 평가 하 고 과정3,4 동안 조직 내의 힘을 측정 하 . 특히 초파리, 상피 레이어 인해 그들의 유사 2D 형상 및 그들의 쉬운 조작에 널리 공부 되었습니다.
다양 한 기술 따라서 우리가 다른 사람에 의해 개발 중 상피 역학에 vivo에서 평가 하기 위해 개발 되었습니다. 우리는 상피 조직에서 사용 하는 세 가지 주요 기술에 대 한 빠른 개요를 줄 것 이다. 레이저 제거, 널리 사용 되는 방법은 로컬 기계적 스트레스 세포 접속점5,6,,78 또는 더 큰 규모9,10,11 허용 로컬 인하 대상의 기계적 무결성 중단을 수행 하 여. 오프닝 컷 다음의 역학 관계와 조직12,13의 유동성 스트레스 이전 절제에 정보를 제공 합니다. 레이저 절제의 단점은 그것이 침략, 셀 피 로컬 중단을 필요로입니다. 하나 조직의 무결성을 유지 하 고 싶은 경우에 따라서, 하나만 제한 된 수의 제거를 수행할 수 있습니다. 또 다른 단점은 오프닝 속도 점성 마찰, 일반적으로 알려져 있지에 따라 달라 집니다 이후 제거 셀 연락처에서 긴장의 상대 견적 제공. 마그네틱 조작 개발 고 초파리, ferrofluids14 의 사용 또는 ultramagnetic 리15포함 사용 또한 있다. 그들은 절대 측정16,17을 제공할 수 있습니다 하지만 그들은 원하는 위치에 프로브의 주입 필요로 하는 의미에서 침략 적 있습니다. 이것은 항상 정확한 주사 의무가 시스템에 따라 매우 어려울 수 있습니다. 세 번째 기술은, 완전히 비-침략 적, 힘 유추18,,1920이다. 힘 유추 트리플 포인트 (tricellular 접합, 또는 정점)에서 기계적 평형의 가정에 그리고 셀 연락처 (그리고, 모든 셀에 압력)에 의해 역 문제 해결 전혀 긴장을 유추할 수 있습니다. 긴장, 각 꼭지점 두 식을 (X 및 Y)를 제공합니다. 이 셀의 모든 접촉에서 긴장을 평가 하기 위해 몇 가지 조건 하에서 반전 될 수 있는 선형 방정식의 큰 시스템을 생성 합니다. 세그먼트 이미지를 아무런 추가 실험 또는 설치만 요구 하는 때이 방법은 매우 매력적인, 동안 그것의 정확도 아직 결정, 그리고 다시만 제공 상대 값, 절대 교정 측정 수행 하지 않는 한.
이러한 한계 들을 극복 하기 위해 우리 소개이 문서에서는 광학 족집게의 설치 제어 세력 초파리 melanogaster의 배아 상피에 셀 규모에 적용할 빛 시트 현미경에 결합. 광학 핀셋 단일 단백질 및 세포와 세포21의 조작에 측정을 포함 하 여 수많은 생물 학적 응용에 대 한 사용 되었습니다. 여기, 우리가 작은 몇 다스 pN의 범위에서 적용 된 힘을 보고 아직 셀 연락처의 로컬 변형 유발 하 고 vivo에서기계 측정을 수행 하기에 충분. 일반적으로, 셀 연락처, kymographs의 분석을 통해 모니터링의 수직 편향 사용 하 여 변형 힘 관계. 중요 한 것은, 우리의 설치 광학 핀셋 직접 셀 연락처에 힘을 발휘할 수 있는 조직에서 원하는 위치에 구슬의 주입을 요구 하지 않는다. 빛 시트 현미경 광학 족집게의 결합 수의 조명부터 매우 감소 된 phototoxicity와 짧은 시간 스케일에서 기계적인 분석에 대 한 감지할 수 있는 빠른 영상 (초당 몇 프레임)을 수행 하는 샘플 영상22의 비행기로 제한 됩니다.
전반적으로, 광학 족집게는 셀 연락처 초파리 태아에서 vivo에서에서 제어 힘을 적용 하 고 경직과 긴장 셀 연락처23, 유 변 학적 특성 기계 정보를 추출 하는 비-침략 적 방법 24, 그리고 그라데이션 또는 긴장23의 이방성.
Protocol
Representative Results
Discussion
광학 족집게는 비-침략 적 방식으로 직접 개발 배아 상피에에서 절대 기계 측정을 수행 하실 수 있습니다. 그런 의미에서 그것은 침략 적 되 고 상대 측정, 주사를 요구 하는 자기 세력을 제공 또는 강한 가정에 의존 하는 유추를 강제로 제공 하 고 또한 상대 레이저 절제 등 다른 방법을 통해 장점을 제공합니다 측량입니다.
프로토콜은 몇 가지 중요 한 단계를 포함합니다. 첫?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 FRM Equipe 그랜트 FRM DEQ20130326509, 직원 회 드 라 검색 ANR 블랑 그랜트, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (P.-플로리다)에 의해 지원 되었다. 우리는 프랑스 국립 연구 기관 (ANR-10-INBS-04-01, «미래에 대 한 투자»)에서 지 원하는 프랑스 BioImaging 인프라를 인정 합니다. 우리 기술 지원에 대 한 PICSL-FBI 인프라에서 브라이스 Detailleur와 클로드 모레티 감사합니다.
Materials
| Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW | IPG Laser | YLM-10-LP-SC | including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser |
| Ø1/2" Optical Beam Shutter | Thorlabs | SH05 | |
| Small Beam Diameter Galvanometer Systems | Thorlabs | GVS001 | 1 for X displacement, 1 for Y displacement |
| 1D or 2D Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | galvanometers power supply |
| 2 lenses f = 30mm | Thorlabs | LB1757-B | relay telescope between 2 galva |
| Lens f = 200mm | Thorlabs | LB1945-B | 2.5X telescope |
| Lens f = 500mm | Thorlabs | LB1869-B | 2.5X telescope |
| Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes | Thorlabs | KCB1E | Periscope |
| Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style | Thorlabs | LG1 | |
| 45° AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror | Edmund Optics | #64-470 | |
| Multiphoton-Emitter HC 750/S | AHF | HC 750/SP | |
| CompactDAQ Chassis | National Instruments | cDAQ-9178 | |
| C Series Voltage Output Module | National Instruments | NI-9263 | Analog output module |
| C Series Voltage Input Module | National Instruments | NI-9215 | Analog input module |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids | ThermoFisher Scientific | F8812 | calibration beads |
| C++ (Qt) home made optical tweezers software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview |
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