ショウジョウバエの胚のビーズ無料光ピンセット プローブ細胞力学
Summary
光シート顕微鏡とショウジョウバエの胚でビーズなし細胞力学をプローブへの実装に結合光ピンセットのセットアップを紹介します。
Abstract
形態形成には、遺伝的パターン形成と細胞や組織をしっかり形に機械力間の調整が必要です。したがって、地形形成過程を理解するための課題は、胚発生の間に細胞の力と体内の力学的性質を直接測定するためです。ショウジョウバエの初期胚の細胞間の接触の力を直接適用することができます、光シート顕微鏡と結合した光ピンセットのセットアップを提案するここでは、いくつかのフレーム/秒の速度でイメージングしながら。この手法には、胚は、通常の光学力が行使が中間のプローブとして使用ビーズの注入を必要としない利点があります。我々 は、ステップバイ ステップのセットアップの実装の詳細し、実験から力学的情報を抽出するためのツールを提案します。細胞細胞の接触リアルタイムの変位を監視することによって張力測定を実行、細胞の接触のレオロジーを調査できます。
Introduction
萌芽期の開発は、その中に細胞や組織を将来の動物の形に変形再現性の高いプロセスです。このような変形は、セル レベル1,2では、軍のアクティブな世代を必要とする示されています。地形形成過程中に細胞や組織は、その形状を変更して、それしたがってキー関係の細胞の力学特性を評価するために、プロセス3,4の間に組織内で力を測定するには.擬 2次元のジオメトリと簡単操作に、ショウジョウバエ、特に上皮の層は広く研究されています。
テクニックの数は、われわれや他の開発中に体内の上皮の力学評価このように開発されています。我々 は上皮組織で使用される 3 つの主要な技術の概要を与えます。セル接合5,6,7,8または9,スケール大きい10,11 のローカルの機械的ストレスを明らかにすることにより、レーザー焼灼、広く使用されている方法ターゲットの力学的整合性を混乱させる地方のカットを実行することによって。カットの次拡大のダイナミクスは、ストレス前アブレーションと組織12,13のレオロジーの両方の情報を提供します。レーザーアブレーションの欠点は、ことだが、侵襲的な細胞の皮質のローカルの中断を必要とです。したがって、試練の限られた数は、1 つは組織の整合性を保持したい場合 1 つのみ実行できます。別の欠点は、開離速度は、一般的に知られていない粘性摩擦に依存なので試練だけ細胞の接触の張力の相対的な見積もりを提供です。磁気操作はまた開発し、ショウジョウバエ、磁性14の使用または ultramagnetic リポソーム15のいずれかを含むで使用されます。彼らは絶対測定16,17を提供することができますが、目的の位置にプローブの注入を要求することの意味で侵襲も。これは常に正確な注射に従順ではないシステムによって非常に難しいことができます。3 番目の手法は、完全に非侵襲的は力の推定18,19,20です。力の推論はトリプル ポイント (tricellular 接合または頂点) で力学的平衡の仮定に依存していると推論する緊張まったく細胞連絡先 (おそらく、すべての細胞圧力) によって逆問題を解くことができます。緊張、各頂点には、2 つの方程式 (X と Y) が用意されています。これにより、大規模な連立一次方程式をすべての細胞の接触の張力を評価するためにいくつかの条件の下で反転することができます。それだけ分割イメージがない余分な実験やセットアップを必要と、この方法は非常に魅力的で、その精度は調べるには、まだ、再び絶対校正測定が行われていない限り、それはのみ相対値を提供します。
これらの制限の一部を克服するために紹介するこの記事の光ピンセットのセットアップキイロショウジョウバエの胚上皮細胞のスケールで制御された力を適用する光シート顕微鏡と結合しました。光ピンセットは、単一蛋白質および細胞内小器官や細胞の21の操作で測定を含む多数の生物学的応用のために使用されています。ここで、報告は小さい少数のダース pN の範囲で応用力まだ細胞の接触のローカル変形を誘発して体内の機械計測を実行するのに十分な。通常、力を変形に関連するのに細胞の接触、kymographs の分析を通して監視の垂直偏向を使用します。重要なは、我々 のセットアップには、光ピンセットは直接細胞間の接触に力を発揮することができる、組織内の目的の場所でビーズの注入は不要です。光シート顕微鏡光学ピンセットのカップリングの照明は非常に減らされた毒性との短い時間スケールで、機械的分析のためかなり高速イメージング (フレーム数/秒) を実行することができます、サンプル画像22の平面に制限されます。
全体的にみて、光ピンセットは、ショウジョウバエ胚の in vivo 細胞の接触力制御を適用して剛性と携帯連絡先23、張力レオロジー特性などの機械情報を抽出する非侵襲的な方法24、グラデーションや異方性張力23。
Protocol
Representative Results
Discussion
光ピンセットは、非侵襲的な方法で発展途上の胚上皮に直接絶対機械計測を実行する許可します。その意味で、それは、侵襲的と磁気力と、注射を必要とする、相対的な測定を提供するまたは強い仮定に依存する推論の力、また相対提供、レーザーアブレーションなど他の方法上の利点を提示します。測定。
プロトコルには、いくつかの重要な手順が含まれています。?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、FRM エキップ グラント FRM DEQ20130326509、アジャンス ナシオナル デ ラ凝った ANR ブラン グラント Morfor ANR-11-BSV5-0008 (に p. f. l.) によって支えられました。我々 は、フランス国立研究機関 (ANR-10-INBS-04-01, «将来の投資») でサポートされているフランス バイオ イメージング インフラストラクチャを認めます。テクニカル サポート PICSL FBI インフラストラクチャからブライス Detailleur とクロード ・ モレッティに感謝します
Materials
| Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW | IPG Laser | YLM-10-LP-SC | including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser |
| Ø1/2" Optical Beam Shutter | Thorlabs | SH05 | |
| Small Beam Diameter Galvanometer Systems | Thorlabs | GVS001 | 1 for X displacement, 1 for Y displacement |
| 1D or 2D Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | galvanometers power supply |
| 2 lenses f = 30mm | Thorlabs | LB1757-B | relay telescope between 2 galva |
| Lens f = 200mm | Thorlabs | LB1945-B | 2.5X telescope |
| Lens f = 500mm | Thorlabs | LB1869-B | 2.5X telescope |
| Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes | Thorlabs | KCB1E | Periscope |
| Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style | Thorlabs | LG1 | |
| 45° AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror | Edmund Optics | #64-470 | |
| Multiphoton-Emitter HC 750/S | AHF | HC 750/SP | |
| CompactDAQ Chassis | National Instruments | cDAQ-9178 | |
| C Series Voltage Output Module | National Instruments | NI-9263 | Analog output module |
| C Series Voltage Input Module | National Instruments | NI-9215 | Analog input module |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids | ThermoFisher Scientific | F8812 | calibration beads |
| C++ (Qt) home made optical tweezers software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview |
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