Een directe kracht sonde voor het meten van de mechanische integratie tussen de kern en het cytoskelet
Summary
In dit protocol beschrijven we een micropipet-methode om een gecontroleerde kracht direct toepassen in de kern in een levende cel. Deze bepaling laat ondervraging van nucleaire mechanische eigenschappen in de cel levend, aanhangend.
Abstract
De mechanische eigenschappen van de kern bepalen haar reactie op mechanische krachten gegenereerd in cellen. Omdat de kern moleculair continu met het cytoskelet is, zijn methoden nodig om de sonde van het mechanische gedrag in Adherente cellen. Hier bespreken we de directe werking sonde (DFP) als een instrument om het geweld zich rechtstreeks wenden tot de kern in een levende aanhangend cel. We hechten een smalle micropipet aan de nucleaire oppervlak afzuigen. De micropipet is vertaald uit de buurt van de kern, waardoor de kern te vervormen en te vertalen. Wanneer het herstel kracht gelijk aan de zuigkracht is, de kern wordt verbroken en elastisch ontspant. Omdat de zuigdruk precies bekend is, is de kracht op het nucleaire oppervlak bekend. Deze methode is gebleken dat de nano-schaal krachten volstaan om te vervormen en vertalen van de kern in Adherente cellen, en geïdentificeerd cytoskeletal elementen waarmee de kern krachten weerstaan. De DFP kan worden gebruikt voor het ontleden van de bijdragen van cellulaire en nucleaire componenten nucleaire mechanische eigenschappen in levende cellen.
Introduction
Ziektebeelden zoals kanker impliceren wijzigingen aan nucleaire vorm en structuur1,2, die over het algemeen vergezeld gaan van een ‘verzachtende’ van de kern3,4. Nucleaire weerstand aan mechanische vervorming in het algemeen gekenmerkt door een kracht naar geïsoleerde kernen5.
De kern in cellen is het moleculair verbonden met het cytoskelet door de Linker van Nucleoskeleton en het cytoskelet (LINC) complexe6,,7,,8,9. Dientengevolge, is de kern mechanisch geïntegreerd met het cytoskelet en, door middel van cel-substraat verklevingen, de extracellulaire matrix. Mechanisch sonderen de kern binnen Adherente cellen kan inzicht geven in deze mechanische integratie. Methoden voor het manipuleren van de kernen in levende cellen omvatten micropipet aspiratie10,11, en atomic force microscopie12,13,14. We onlangs beschreven een directe kracht-sonde (DFP) toepassing van mechanische krachten direct bij de kern in een levende aanhangend cel15.
We schetsen hier, de procedure voor het gebruik van een systeem van microinjection dat is vaak beschikbaar in microscopie faciliteiten toe te passen een bekende, nano-schaal mechanische kracht direct op de kern in een aanhangend cel. Een femtotip (0,5 µm diameter micropipet tip) is gemonteerd en aangesloten op het systeem van microinjection door een buis. De tip, geplaatst in een hoek van 45° ten opzichte van het oppervlak van de cultuur schotel, is verlaagd tot grenzend aan het nucleaire oppervlak. De buis is vervolgens verbroken en opengesteld voor de sfeer, die wordt gemaakt van een negatieve zuigdruk op het nucleaire oppervlak en bezegelt het uiteinde van de micropipet tegen de nucleaire oppervlak. Door middel van vertaling van de micropipet tip, is de kern vervormd en uiteindelijk (afhankelijk van de omvang van de uitgeoefende kracht), los van de micropipet. Dit detachement treedt op wanneer herstel (weerstand) krachten, uitgeoefend door de celkern en cel, gelijk de zuigkracht toegepast door de micropipet. Analyse kan worden uitgevoerd door het meten van de verplaatsing van de kern, de lengte stam (vergelijking 1) of de stam van de ruimte (figuur 1A).
Protocol
Representative Results
Discussion
Het meten van de mechanische integratie van de kern met het cytoskelet is een uitdaging voor de meest actuele methoden, zoals micropipet aspiratie16, omdat ze beide geïsoleerde kernen (waar de kern is van het cytoskelet ontkoppelde) vereisen of kernen in zwevende cellen (waar de extracellulaire krachten, zoals tractie krachten, zijn afwezig is). Kracht is vereffend met de nucleus door biaxial stam toe te passen op cellen aanhanger naar een membraan17,<sup class=…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de NIH R01 EB014869.
Materials
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
Referenzen
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
- Bank, E. M., Gruenbaum, Y. The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship. Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).
- Lammerding, J., et al. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).
- Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures. Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).
- Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins. Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).
- Tapley, E. C., Starr, D. A. Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).
- Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
- Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency. Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).
- Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope. Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).
- Pagliara, S., et al. Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency. Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).
- Liu, H., et al. In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy. ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).
- Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy. Physical Biology. 10 (6), 065002 (2013).
- Neelam, S., et al. Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).
- Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
- Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation. Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).
- Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells. Methods. 94, 27-32 (2016).
