Çekirdek ve sitoiskeleti mekanik bütünleşmesi ölçmek için bir doğrudan kuvvet sonda
Summary
Bu protokol için doğrudan bir yaşam Hücre çekirdeğinde kontrollü bir kuvvet uygulamak için micropipette yöntemi açıklanmaktadır. Bu tahlil sorgulama yaşayan, yapisan hücredeki nükleer mekanik özellikleri sağlar.
Abstract
Çekirdeği mekanik özellikleri mekanik Kuvvetleri hücrelerinde üretilen onun yanıt belirler. Çekirdek ile sitoiskeleti tatlı sürekli olduğundan, yöntemleri mekanik davranışını yapisan hücrelerdeki soruşturma için ihtiyaç vardır. Burada, doğrudan gücü probun (DFP) doğrudan bir yaşam yapisan Hücre çekirdeğinde kuvvet uygulamak için bir araç olarak tartışmak. Emme nükleer yüzeye dar bir micropipette ekleyin. Micropipette deforme ve çevirmek çekirdek neden olan çekirdek uzak çevrilir. Geri yükleme kuvvetleri emiş gücüne eşit olduğunda, çekirdek ayırır ve Melosun rahatlatır. Emiş basıncı kesin olarak bilindiğinden, güç nükleer yüzeyi bilinir. Bu yöntem nano ölçekli güçleri deforme ve yapışık Hücre çekirdeğinde çevirmek için yeterli ve kuvvetler direnmeye çekirdek etkinleştirmek hücre iskeleti elemanlar ortaya koymuştur. DFP hücresel ve nükleer bileşenleri nükleer mekanik özellikleri canlı hücreler’katkılarıyla incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Patolojiler kanser gibi nükleer şekli ve yapısı1,2, genellikle bir ‘yumuşama’ çekirdek3,4tarafından yayımlanır değişiklikleri içerir. Nükleer mekanik deformasyon direnci genellikle izole çekirdeği5‘ e bir kuvvet uygulayarak karakterize.
Hücre çekirdeğinde tatlı sitoiskeleti için bağlayıcı Nucleoskeleton ve sitoiskeleti (LINC) karmaşık6,7,8,9tarafından bağlanır. Sonuç olarak, çekirdek mekanik sitoiskeleti ile ve hücre-terkedilemeyen yapışıklıklar, hücre dışı matriks ile entegre edilmiştir. Mekanik yapışık hücreleri içinde çekirdek sondalama mekanik Bu entegrasyon içgörü sağlayabilir. Micropipette aspirasyon10,11ve atomik kuvvet mikroskobu12,13,14çekirdeği canlı hücreler içinde işlemek için yöntemler içerir. Biz son zamanlarda bir yaşam yapisan hücre15çekirdeğinde doğrudan mekanik Kuvvetleri uygulandığı bir doğrudan kuvvet sonda (DFP) nitelendirdi.
Burada, mikroskobu tesislerinde doğrudan yapisan bir hücre çekirdeğinde için bilinen, nano ölçekli mekanik kuvvet uygulamak için yaygın olarak kullanılabilir bir mikroenjeksiyon sistemi kullanan yordamı anahat. Bir femtotip (0.5 µm çapı micropipette tıp) monte ve bir tüp tarafından mikroenjeksiyon sisteme bağlı. Kültür çanak yüzeyine göre 45 ° açıyla konumlandırılmış uç, bitişik kadar nükleer yüzeye indirilir. Tüp sonra bağlantısı kesilen ve nükleer yüzeyinde negatif bir emme basınç oluşturur ve nükleer yüzeye karşı micropipette ipucu mühürler atmosfere açtı. Çeviri micropipette uç çekirdeği deforme ve sonunda (büyüklüğü yük bağlı olarak), micropipette ilişkisi kesildi. Bu dekolmanı çekirdek ve hücre, tarafından sarf geri yükleme (dirençli) kuvvetleri micropipette tarafından uygulanan emiş gücü eşit oluşur. Çözümleme yapılır çekirdeği, deplasman ölçerek uzunluğu zorlanma (denklem 1) veya alan zorlanma (Şekil 1A).
Protocol
Representative Results
Discussion
(Çekirdek nerede sitoiskeleti bilgisini iletmiyor) her iki izole çekirdeği gerektirdiğinden sitoiskeleti çekirdekle mekanik entegrasyonu ölçme micropipette aspirasyon16gibi en yeni yöntemleri için bir meydan okuma olduğunu veya çekirdekleri askıya alınmış hücrelerindeki (hücre dışı güçleri, çekiş güçleri gibi eksik durumda). Güç çekirdeğine hücre yapışık bir membran17,18biaxial baskı uygulayarak uygulanm?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NIH R01 EB014869 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
Referenzen
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
- Bank, E. M., Gruenbaum, Y. The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship. Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).
- Lammerding, J., et al. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).
- Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures. Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).
- Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins. Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).
- Tapley, E. C., Starr, D. A. Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).
- Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
- Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency. Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).
- Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope. Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).
- Pagliara, S., et al. Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency. Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).
- Liu, H., et al. In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy. ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).
- Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy. Physical Biology. 10 (6), 065002 (2013).
- Neelam, S., et al. Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).
- Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
- Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation. Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).
- Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells. Methods. 94, 27-32 (2016).
