Eine direkte Kraft-Sonde zur Messung der mechanischen Integration zwischen dem Kern und dem Zytoskelett
Summary
In diesem Protokoll beschreiben wir eine Mikropipette-Methode, um eine kontrollierte Kraft direkt in den Zellkern in einer lebenden Zelle anwenden. Dieser Test ermöglicht Verhör der nuklearen mechanischen Eigenschaften in der lebendigen, anhaftende Zelle.
Abstract
Die mechanischen Eigenschaften des Kerns bestimmen seine Reaktion auf mechanische Kräfte, die in den Zellen erzeugt. Da der Kern mit dem Zytoskelett Molekular kontinuierlich ist, werden Methoden benötigt, das mechanische Verhalten in adhärenten Zellen zu untersuchen. Hier diskutieren wir die unmittelbaren Zwangs-Sonde (DFP) als Instrument zur Kraft direkt in den Zellkern in lebenden adhärente Zellen anwenden. Wir legen einen schmalen Mikropipette zur nuklearen Oberfläche mit Absaugung. Die Mikropipette wird vom Nucleus, übersetzt, was bewirkt, den Kern dass zu verformen und zu übersetzen. Wenn die Rückstellkraft der Saugkraft entspricht, wird der Kern löst und elastisch entspannt. Da der Saugdruck genau bekannt ist, wird die Kraft auf die nukleare Oberfläche bezeichnet. Diese Methode hat ergeben, dass Nano-Maßstab Kräfte ausreichen, um zu verformen und übersetzen den Zellkern in adhärenten Zellen und identifiziert Zellskelett Elemente, mit die den Kern Kräften widerstehen können. Die DFP kann verwendet werden, um die Beiträge der zellulären und nuklearen Komponenten zur nuklearen mechanischen Eigenschaften in lebenden Zellen zu sezieren.
Introduction
Krankheiten wie Krebs betreffen Änderungen an nuklearen Form und Struktur1,2, die in der Regel von einer Erweichung der Kern3,4begleitet werden. Nukleare Widerstand gegen mechanische Verformung hat in der Regel durch Krafteinwirkung auf isolierten Kernen5gekennzeichnet.
Kern in Zellen ist Molekular mit dem Zytoskelett der Linker Nucleoskeleton und Cytoskelett (LINC) komplexe6,7,8,9verbunden. Infolgedessen ist der Kern mechanisch mit dem Zytoskelett und durch Zelle-Substrat Verwachsungen, die extrazelluläre Matrix integriert. Mechanisch sondieren des Kerns im Inneren adhärente Zellen bieten einen Einblick in diese mechanischen Integration. Methoden der Kerne in lebenden Zellen zu manipulieren zählen Mikropipette Anspruch10,11und atomic Force Microscopy12,13,14. Wir beschrieben vor kurzem eine unmittelbaren Zwangs-Sonde (DFP), die mechanische Kräfte direkt auf den Kern in einem lebendigen adhärente Zellen15gilt.
Hier beschreiben wir das Verfahren für die Nutzung einer Mikroinjektion Systems, die häufig in Mikroskopie Einrichtungen, eine bekannte, Nano-Maßstab mechanische Kraft direkt in den Zellkern in eine adhärente Zellen anzuwenden. Ein Femtotip (0,5 µm Durchmesser Mikropipette Spitze) ist montiert und die Mikroinjektion System durch ein Rohr verbunden. Der Tipp, positioniert in einem 45° Winkel relativ zur Oberfläche der Kulturschale sinkt bis angrenzend an der nuklearen Oberfläche. Das Rohr ist dann nicht getrennt und die Atmosphäre, die schafft eines negativen Saugdruck an der nuklearen Oberfläche und dichtet die Mikropipette Spitze gegen die nukleare Oberfläche eröffnet. Durch die Übersetzung der Mikropipette Spitze ist der Kern verformt und schließlich (abhängig von der Größe der Krafteinwirkung), losgelöst von der Mikropipette. Diese Abteilung tritt auf, wenn die Rückstellkräfte (widerstehen), ausgeübt durch den Kern und die Zelle, die Saugkraft durch die Mikropipette aufgetragen gleich. Analyse kann erfolgen durch die Verschiebung des Kerns, Messung der Länge Dehnung (Gleichung 1) oder der Bereich Belastung (Abb. 1A).
Protocol
Representative Results
Discussion
Messung der mechanischen Integration des Kerns mit dem Zytoskelett ist eine Herausforderung für die aktuellsten Methoden, z. B. Mikropipette Anspruch16, weil sie entweder einzelne Kerne erfordern (wo ist der Kern von dem Zytoskelett entkoppelt) oder Kerne in den suspendierten Zellen (wo extrazelluläre Kräften wie Zugkräfte, fehlen). Auf den Kern wurde Kraft angewandt, indem biaxiale Beanspruchung auf Zellen Anhänger auf eine Membran17,18</s…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von NIH R01 EB014869 unterstützt.
Materials
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | discontinued, current equivalent model: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Current model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor oil immersion 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF oil immersion 60x | Nikon | NA | |
| Donor Bovine Serum (DBS) | ThermoFisher Scientific | 16030074 | NIH 3T3 serum |
| Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 medium |
| Penicillin-Streptomycin | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 medium supplement |
| Immersion Oil Type LDF Non-Fluorescing | Nikon | 77007 | Immersion oil for objective lens |
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