Dynamische Adhäsion Assay für die funktionelle Analyse von Anti-Adhäsion Therapien bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen
Summary
Dynamische Adhäsion von Immunzellen, die Gefäßwand ist eine Voraussetzung für Darm-Homing. Hier präsentieren wir ein Protokoll für einen funktionellen in Vitro Assay für die Impact-Analyse der Antikörper Anti-Integrin, Chemokine oder andere Faktoren auf die dynamische Zelladhäsion von menschlichen Zellen mit Bearbeit-beschichteten Kapillaren.
Abstract
Darm-Homing von Immunzellen ist wichtig für die Pathogenese der entzündlichen Darmerkrankungen (IBD). Integrin-abhängige Zelladhäsion, Addressins ist ein entscheidender Schritt in diesem Prozess und therapeutische Strategien stören Adhäsion haben erfolgreich etabliert. Der Anti-α4β7 Integrin Antikörper, Vedolizumab, dient der klinischen Behandlung von Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa (UC) und weitere Verbindungen sind wahrscheinlich folgen.
Die Einzelheiten des Verfahrens Adhäsion und Wirkungsmechanismen von Anti-Integrin-Antikörper sind in vielerlei Hinsicht aufgrund der begrenzten verfügbaren Techniken für die funktionelle Forschung in diesem Bereich noch unklar.
Hier präsentieren wir Ihnen eine dynamische Adhäsion-Assay für die funktionelle Analyse der menschlichen Zelle Adhäsion unter Strömungsverhältnisse und die Auswirkungen der Anti-Integrin-Therapien im Rahmen der IBD. Es basiert auf die Perfusion der primären humanen Zellen durch Bearbeit-beschichtete ultradünnen Glaskapillaren mit mikroskopischen Analysen in Echtzeit. Der Test bietet eine Vielzahl von Möglichkeiten für Verbesserungen und Modifikationen und Potenziale für die mechanistischen Entdeckungen und Translationale Anwendungen hält.
Introduction
Zelle Bewegung ist ein streng regulierten Prozess unverzichtbar für die Entwicklung und Funktion der mehrzelligen Organismen, sondern ist auch in der Pathogenese zahlreicher Erkrankungen1verwickelt. Homing Prozess der Immunzellen aus dem Blutstrom zu den peripheren Geweben hat vor kurzem, zunehmende Aufmerksamkeit gewonnen, da sie Nachschub und Ausbau der pathogene Zellen in entzündetem Gewebe bei immunologisch vermittelten Erkrankungen2 fördert ,3. Referenzfahrt ist insbesondere nachweislich, translationale Relevanz bei entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) zu haben. Die therapeutische Anti-α4β7 Integrin Antikörper Vedolizumab Darm referenzieren stören hat Wirksamkeit gezeigt, in großen klinischen Studien4,5 und erfolgreich eingesetzt in der klinischen Praxis6,7 , 8. weitere Verbindungen sind wahrscheinlich9,10folgen. Ebenso ist der therapeutische Anti-α4-Integrin-Antikörper, Natalizumab, zur Behandlung von Multipler Sklerose (MS)11verwendet.
Unsere funktionalen Verständnis des homing-Prozesses im allgemeinen und der Mechanismus der Wirkung solcher therapeutischer Antikörper ist insbesondere jedoch nach wie vor begrenzt. Es ist allgemein bekannt, dass Homing aus mehreren Schritten besteht, einschließlich der Zelle tethering und Walzen mit nachfolgenden Zelladhäsion, zur festen Festnahme gefolgt von Trans endotheliale Migration12,13. Die oben genannten Antikörper neutralisieren Integrine auf der Zelloberfläche, die Interaktion mit Addressins auf das Endothel der Gefäßwand zu verhindern. Dies ist gedacht, um feste Zelle Adhäsion14,15behindern. Allerdings sind wir erst am Anfang zu verstehen, die differenzierte Relevanz der spezifischen Integrine für Zelle Homing von eindeutigen Zelle Teilmengen. Darüber hinaus die Auswirkungen der Anti-Integrin-Antikörper auf verschiedenen Zelle Teilmengen und Dosis-Wirkungs-Verbände sind weitgehend unbekannt, was zu viele offene Fragen auf dem Gebiet der Darm homing und Anti-Adhäsion Therapien in IBD.
Praktische Tools für solche Fragen sind daher dringend erforderlich. Die Wirkung von Anti-Integrin-Antikörper auf Integrin-Bearbeit Interaktion ist bisher überwiegend ausgewertet worden, durch die Beurteilung verbindliche Wirksamkeit/Bindung Hemmung mit Durchflusszytometrie oder durch statische Haftung Assays16,17 ,18,19,20, also mit scheinbaren Vereinfachung und Abweichung von der physiologischen Situation. Wir hat kürzlich einen dynamischen Adhäsion-Assay Integrin-abhängige Adhäsion von menschlichen Zellen, Addressins und die Auswirkungen der Anti-Integrin-Antikörpern unter Scherbelastung2studieren. Das Prinzip der Technik wurde früher mit Maus Zellen21,22nachgewiesen. Hier wurde es angepasst und entwickelt, um die oben genannten translatorische Fragen, Eröffnung neuartige Wege zum besseren Verständnis der Mechanismen der Therapie mit Anti-Integrin Antikörper in Vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das obige Protokoll beschreibt eine nützliche Technik, um dynamische Haftung der menschlichen Immunzellen zur endothelialen Liganden zu studieren. Durch Variation der beschichteten Liganden PERFUNDIERTEN Zelltypen oder Teilmengen, die Inkubation mit zusätzlichen Reize oder verschiedene neutralisierende Antikörper, es hat fast unbegrenzte Einsatzmöglichkeiten. Daher können solche dynamischen Adhäsion Assays nützlich sein, sowohl grundlegende Fragen der Grundlagenforschung sowie translational Abfragen, die helfen k?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschung von CN, IA, MFN und SZ wurde unterstützt durch das interdisziplinäre Zentrum für klinische Forschung (IZKF) und der ELAN-Programm der Universität Erlangen-Nürnberg, der Else Kröner-Fresenius-Stiftung, der Fritz-Bender-Stiftung, die deutsche Morbus Crohn und Ulcerosa Foundation (DCCV), die klinische Forschung Gruppe CEDER von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), das DFG-Thema-Programm auf Mikrobiota, Emerging-Feld-Initiative und die DFG Collaborative Research Centers 643, 796 und 1181.
Materials
| 48-Well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20×2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 ml Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
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