선 동적인 장 질병에 방지 접착 치료의 기능 분석에 대 한 동적 접착 시험
Summary
혈관 벽에 면역 세포의 동적 접착 용기 추적에 대 한 전제 조건입니다. 여기, 우리 addressin 코팅 모 세관을 사용 하 여 인간 세포의 동적 세포 접착에 안티 integrin 항 체, 발산 또는 다른 요인의 영향 분석에 대 한 기능 생체 외에서 시험에 대 한 프로토콜을 제시.
Abstract
면역 세포의 본질적인 유도 선 동적인 장 질병 (IBD)의 병 인에 대 한 중요 하다. Integrin 종속 셀 접착 addressins이 과정에서 중요 한 단계 이며 접착을 방해 하는 치료 전략 성공적으로 설립 되었습니다. 궤 양성 대 장 염 (UC) 더 화합물 들을 따라 및 안티 α4β7 integrin 항 체, vedolizumab, Crohn의 질병 (CD)의 임상 치료를 위해 사용 됩니다.
접착 절차의 세부 사항 및 작업 메커니즘 안티 integrin 항 체의이 분야에서 기능 연구에 대 한 제한 된 사용 가능한 기술 때문에 많은 관계에서 여전히 명확 하지 않다.
여기, 우리는 IBD의 맥락에서 흐름 조건 하에서 인간의 세포 접착의 기능 분석 및 안티 integrin 치료의 영향에 대 한 동적 접착 분석 결과 제시. 그것은 실시간 현미경 분석 addressin 코팅 ultrathin 유리 모 세관을 통해 기본 인간 세포의 재 관류를 기반으로 합니다. 분석 결과 다양 한 수정 및 수정에 대 한 기회를 제공 하 고 기계적 발견 및 변환 응용 프로그램에 대 한 잠재력을 보유 하 고.
Introduction
셀 모션 단단히 규제 프로세스 개발 및 멀티 셀룰러 생물의 기능에 대 한 필수 이지만, 또한 다양 한 질병1의 병 인에 관련 된. 최근, 주변 조직에 혈 류에서 면역 세포의 유도 과정 주목 하고있다 증가, 때문에 그것은 보충 및 면역학 중재 질병2에에서 염증된 조직에 병원 성 세포의 확장에 기여 ,3. 특히, 유도 선 동적인 장 질병 (IBD)에 변환 관련성을가지고 표시 되었습니다. 창 추적 방해 치료 안티-α4β7 integrin 항 체 vedolizumab 큰 임상 시험4,5 에 효능을 보이고 있다 고 실제 임상 실습6,7 에 성공적으로 사용 되었습니다. , 8. 추가 화합물9,10에 따라 가능성이 있습니다. 마찬가지로, 치료 안티-α4 integrin 항 체, natalizumab, 다 발성 경화 증 (MS)11의 치료를 위해 사용 됩니다.
그러나, 우리의 기능 유도 과정의 일반적 이해와 같은 치료 항 체의 행동의 메커니즘에 특히 아직도 제한 된다. 잘 설립 추적 셀 밧줄 등 압 트랜스 내 피 마이그레이션12,13다음 회사 마비로 이어지는 후속 세포 접착와 여러 단계의 구성 됩니다. 위에서 언급 한 항 체에 혈관 벽의 endothelium에 addressins와의 상호 작용을 방지 하는 세포 표면 integrins 무력화. 이 회사 세포 접착14,15방해 하 생각 된다. 그러나, 우리는 고유 셀 하위 집합의 셀 추적에 대 한 특정 integrins의 차동 관련성 이해만 시작 합니다. 또한, 다른에 안티 integrin 항 체의 효과 셀 하위 집합 그리고 복용량 응답 협회는 크게 알려진 많은 IBD에 직감 추적 및 방지 접착 치료의 분야에서 관련 질문을 선도.
따라서, 이러한 질문을 해결 하기 위해 편리한 도구 필사적으로 필요 합니다. Integrin addressin 상호 작용에 안티 integrin 항 체의 효과 주로 바인딩 효능/바인딩 금지 cytometry 또는 정적 접착 분석 실험16,17 를 평가 하 여 평가 18,,1920, 명백한 단순화와 생리 적 상황에서 편차에 따라서. 우리는 최근에 integrin 종속 접착 addressins 인간 세포의 전단 응력2안티 integrin 항 체의 효과 공부 하 고 동적 접착 분석 결과 설립. 기술의 원리 이전 마우스 셀21,22로 입증 되었습니다. 여기, 그것은 적응 되 고 위에서 언급 한 변환 질문을 해결 하기 위해 개발 되었다, 오프닝 소설 길 더 나은 치료와 안티 integrin 항 체에서 생체 내에서의 메커니즘을 이해.
Protocol
Representative Results
Discussion
위의 프로토콜 인간의 면역 세포를 내 피 ligands의 동적 접착을 공부 하는 유용한 기법을 설명 합니다. 통해 코팅된 ligands, 끼얹는다 세포 유형 또는 하위 집합, 추가 자극이 나 다른 중화 항 체를 가진 외피의 변화, 그것은 거의 무제한 잠재적인 응용 프로그램. 따라서, 이러한 동적 접착 분석 변환 쿼리를 개발 하 고 접착 과정을 방해 하는 약물으로 임상 치료를 최적화 하는 데 도움이 될 뿐 아니라 …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CN, 아이오와, MFN, SZ의 연구 지원 협 센터 임상 연구 (IZKF)와 대학 에를랑겐 뉘른베르크, 독일 크 론 다른 Kröner-Fresenius-재단, 프리츠-벤더-재단의 앨런 프로그램 및 Colitis 재단 (DCCV), 임상 연구 그룹 CEDER의 독일 연구 위원회 (DFG), Microbiota, 신흥 분야 이니셔티브는 DFG 공동 연구 센터 643, 796와 1181에 DFG 주제 프로그램.
Materials
| 48-Well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20×2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 ml Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
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