Ensaio de adesão dinâmico para a análise funcional das terapias antiaderência na doença inflamatória intestinal
Summary
Adesão dinâmica de células imunes a parede do vaso é um pré-requisito para hospedagens de intestino. Aqui, apresentamos um protocolo para um ensaio funcional em vitro para a análise de impacto de anticorpos anti-integrina, quimiocinas ou outros fatores sobre a adesão da dinâmica celular de células humanas usando capilares morada-revestido.
Abstract
Orientação de intestino de células do sistema imunológico é importante para a patogênese de doenças inflamatória intestinal (IBD). Aderência de célula dependente de integrinas para addressins é um passo crucial neste processo e interferir com a adesão de estratégias terapêuticas foram estabelecidas com sucesso. O anticorpo anti-α4β7 de integrina, vedolizumab, é usado para o tratamento clínico da doença de Crohn (CD) e colite ulcerativa (UC) e mais compostos são propensos a seguir.
Os detalhes do processo de adesão e os mecanismos de ação dos anticorpos anti-integrina não são ainda claras em muitos aspectos, devido às limitadas técnicas disponíveis para a pesquisa funcional neste campo.
Aqui, apresentamos um ensaio dinâmico de adesão para a análise funcional da aderência de célula humana sob condições de fluxo e o impacto das terapias anti-integrina no contexto do IBD. Ele se baseia a perfusão de células humanas primárias através de capilares de vidro ultrafinos morada revestido com análise microscópica em tempo real. O ensaio oferece uma variedade de oportunidades de melhorias e modificações e detém potenciais para descobertas mecanicistas e aplicações translacionais.
Introduction
Movimento de célula é um processo bem regulamentada área indispensável para o desenvolvimento e a função dos organismos multicelulares, mas também está implicado na patogênese de uma infinidade de doenças1. Recentemente, o processo de localização de células do sistema imunológico do fluxo de sangue para os tecidos periféricos ganhou a atenção crescente, uma vez que contribui para a reposição e expansão de células patogênicas em tecidos inflamados em doenças imunologicamente mediadas2 ,3. Em particular, homing foi mostrado para ter relevância translacional em doenças inflamatória intestinal (IBD). A terapêutica anti-α4β7 integrina anticorpo vedolizumab interferir com orientação de intestino tem demonstrado eficácia em ensaios clínicos grande4,5 e tem sido utilizado com sucesso na prática clínica do mundo real6,7 , 8. outras compostos são propensos a seguir9,10. Da mesma forma, o anticorpo de integrina terapêutica anti-α4, natalizumab, é usado para o tratamento da esclerose múltipla (em)11.
No entanto, nossa compreensão funcional do processo de sinalização em geral e o mecanismo de ação de tais anticorpos terapêuticos em particular ainda é limitada. Está bem estabelecido que a orientação consiste de várias etapas, incluindo a célula tethering e rolando com aderência de célula subsequente levando a prisão firme, seguido por trans endoteliais migração12,13. Os anticorpos acima mencionados neutralizam integrinas na superfície das células, impedindo a interação com addressins no endotélio da parede do vaso. Isto é pensado para impedir a aderência de célula firme14,15. Ainda, estamos apenas começando a entender a relevância diferencial das integrinas específicas para orientação de célula de subconjuntos distintos de célula. Além disso, os efeitos dos anticorpos anti-integrina em diferentes subconjuntos de células e associações de dose-resposta são em grande parte desconhecidas, levando a muitas questões no campo das terapias de localizador e antiaderência de intestino no IBD.
Portanto, ferramentas convenientes para abordar tais questões são desesperadamente necessários. O efeito dos anticorpos anti-integrina na interação integrina-morada predominantemente até agora tem sido avaliado por avaliar a inibição da eficácia/vinculação vinculação com citometria de fluxo ou através de de16,de ensaios de adesão estática17 ,19,18,20, assim, com a aparente simplificação e desvio da situação fisiológica. Recentemente estabelecemos um ensaio de adesão dinâmico para estudar dependente de integrinas adesão de células humanas para addressins e os efeitos dos anticorpos anti-integrina sob tensão de cisalhamento2. O princípio da técnica anteriormente foi demonstrado com rato células21,22. Aqui, foi adaptado e desenvolvido para abordar as questões acima mencionadas translacionais, abertura de avenidas romance para melhor compreender os mecanismos da terapia com anti-integrina anticorpos na vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo acima descreve uma técnica útil para estudar a dinâmica adesão das células do sistema imunológico humanas para ligantes endoteliais. Através da variação dos ligantes revestidos, tipos de células perfundidos ou subconjuntos, incubação com estímulos adicionais ou diferentes anticorpos neutralizantes, que tem quase ilimitada de aplicações potenciais. Portanto, tais ensaios dinâmicos de adesão podem ser útil para responder a ambas as questões fundamentais da pesquisa básica, bem como consultas…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa de CN, IA, MFN e SZ foi apoiada pelo centro interdisciplinar para pesquisa clínica (IZKF) e o programa ELAN da Universidade de Erlangen-Nuremberga, a outra Kröner-Fresenius-Stiftung, o Fritz-Bender-Stiftung, o alemão de Crohn e Colite Foundation (DCCV), a CEDER de grupo investigação clínica do Conselho alemão de pesquisa (DFG), DFG tópico programa de Microbiota, a iniciativa de campo emergente e a DFG Collaborative Research centros 643, 796 e 1181.
Materials
| 48-Well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20×2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 ml Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
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