炎症性腸疾患における癒着防止治療の機能分析のための動的接着アッセイ
Summary
血管壁への免疫細胞の動的付着腸内ホーミングの前提条件です。アドレスを持つコーティング毛細血管を用いた細胞の動的な細胞接着機能の in vitroアッセイ抗インテグリン抗体、ケモカインやその他の要因の影響分析のためのプロトコルを紹介します。
Abstract
腸の免疫細胞のホーミングは、炎症性腸疾患 (IBD) の病因のために重要です。Addressins インテグリン依存性細胞接着はこのプロセスの重要なステップと接着を妨げる治療戦略が確立されました。Vedolizumab、反 α4β7 インテグリン抗体はクローン病 (CD) の臨床治療に使用されて、潰瘍性大腸炎 (UC) やさらに化合物に従う可能性があります。
接着手順の詳細と抗インテグリン抗体の作用機構はこの分野の機能研究の限られた利用可能な技術のための多くの点でまだ不明。
IBD のコンテキストのフロー条件の下でひと細胞接着の機能解析と抗インテグリン療法の影響の動的接着アッセイを紹介します。それはリアルタイムの微視的解析とのアドレスを持つ極薄ガラス毛細血管を通じてひと初代細胞の灌流に基づいています。アッセイは、さまざまな改良と変更のための機会を提供しています、機構の発見と医療応用のためのポテンシャルを保持します。
Introduction
細胞運動は堅く調整されたプロセスの開発と多細胞生物の機能に不可欠なのですが、疾患1の多数の発症にも関与しています。最近では、末梢の組織に血流から免疫細胞のホーミング過程注目を集めて増加、以来、補給と免疫学的疾患2 の炎症組織における病原性細胞の拡大に貢献 ,3。特に、ホーミングは、炎症性腸疾患 (IBD) の並進運動の関連性を持っている示されています。腸ホーミング干渉治療抗 α4β7 インテグリン抗体 vedolizumab 大規模臨床試験4,5で効力を示したし、リアルな実習6,7で正常に使用されています,8します。 それ以上の化合物が9,10をたどる可能性が高い。同様に、示す間、natalizumab、治療抗 α4 インテグリン抗体は多発性硬化症 (MS)11の治療に使用されます。
しかし、一般的にホーミング過程の機能理解とそのような抗体医薬の作用機序特にはまだ限られています。それ、定着してホーミングは携帯のテザリングとトランス内皮移行12,13続いて事務所の逮捕に至るその後の細胞接着とローリングなどを含むいくつかの手順で構成されています。上記の抗体は、血管壁の内皮細胞上の addressins との相互作用を防止する細胞表面のインテグリンを中和します。これはしっかりした細胞接着14,15を妨げると考えられます。まだ、我々 はのみ特定インテグリンの細胞のサブセットの細胞のホーミングの差分の関連性を理解し始めています。また、別に及ぼす抗インテグリン抗体細胞サブセット、用量反応の関連付けが IBD の腸ホーミングと癒着防止療法の分野でオープンな質問の多くにつながる主に知られています。
したがって、このような質問に対処するための便利なツールは必死に必要とします。インテグリン アドレスを持つ相互作用に及ぼす抗インテグリン抗体が結合効果/結合阻害フローサイトメトリーまたは静的接着アッセイ16,17 までを評価することによって主に評価されたところ、18,19、20、従って明白な簡素化と生理学的な状況からの偏差。最近、addressins にひと細胞のインテグリン依存付着とせん断応力2抗インテグリン抗体の効果を研究する動的接着アッセイを設立しました。技術の原理は以前マウス細胞21,22で実証されています。ここでは、適応され、上記の並進の質問に対処する開発、開口部より新規道療法抗インテグリン抗体は体内のメカニズムを理解します。
Protocol
次のセクションで説明した研究は、フリードリヒ ・ アレクサンダー大学エアランゲン-ニュルンベルグの倫理委員会の承認に従ってなされています。 1. 毛細血管の準備 小さなハサミで一側のチューブを伸ばし、慎重に毛細血管 (約 0.5 cm) をチューブに挿入によって長方形の毛細血管をゴム管に接続します。毛細血管とプラスチック パラフィン フィルム チューブ?…
Representative Results
提示法細胞接着と干渉している抗体の役割この原稿で機能的にできるだけ密接に人間細胞接着内皮壁体内プロセスをシミュレートすることを目的を評価します。したがって、極薄の毛細血管は addressins でコーティング、灌流ポンプを使用して興味の蛍光に分類されたひと細胞の灌流します。生細胞イメージング、addressins にひと細胞の接着を使用しては、リア?…
Discussion
上記のプロトコルでは、内皮細胞リガンドに人間の免疫細胞の動的接着を研究する有用な手法について説明します。コーティングされた配位子、灌流セルタイプまたはサブセット、追加刺激または異なる中和抗体の孵化の変化を通じてそれがほぼ無制限の潜在的なアプリケーション。したがって、このような動的接着アッセイを開発し、接着プロセスと干渉する薬剤と臨床治療を最適化に役?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CN, アイオワ、MFN と SZ の研究臨床研究 (IZKF) のエアランゲン ・ ニュルンベルグ大学他 Kröner フレゼニウス財団、フリッツ ・ ベンダー財団、ドイツ Crohn のエラン プログラム学際センターに支えられ、大腸炎財団 (DCCV) が臨床研究グループ杉ドイツ研究議会 (DFG)、細菌叢、フィールドの新たなイニシアチブ、DFG 共同研究センター 643, 796 と 1181 DFG トピック プログラムの。
Materials
| 48-Well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20×2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 ml Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
Referenzen
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Becker, E., Schramm, S., Binder, M., Allner, C., Wiendl, M., Neufert, C., Atreya, I., Neurath, M., Zundler, S. Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease. J. Vis. Exp. (139), e58210, doi:10.3791/58210 (2018).