فوتوبليتشينج يمكن تصوير القرار فائقة من الحلبة فتسز في سيانوباكتيريوم بروتشلوروكوككوس
Summary
هنا يمكننا وصف أسلوب فوتوبليتشينج للحد من أوتوفلوريسسينسي من البكتيريا الزرقاء. بعد فوتوبليتشينج، يستخدم الميكروسكوب التعمير البصرية العشوائية للحصول على صور ثلاثية الأبعاد فائقة القرار من الحلبة فتسز سيانوباكتيريال.
Abstract
مجهرية فائقة القرار قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة التفاعلات بين البروتينات وهياكل سوبسيلولار في العديد من الكائنات الحية. في الكائنات الحية التمثيل الضوئي، بيد القرار الأفقي لتصوير فائقة القرار هو فقط 100 ~ شمال البحر الأبيض المتوسط. انخفاض القرار يرجع أساسا إلى خلفية أوتوفلوريسسينسي عالية من التمثيل الضوئي الخلايا الناجمة عن أشعة الليزر عالية الكثافة المطلوبة لتصوير فائقة القرار، مثل إعادة الإعمار البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة). هنا، يمكننا وصف ساعد فوتوبليتشينج عاصفة أسلوب الذي تم تطويره مؤخرا للتصوير بيكوسيانوباكتيريوم البحرية بروتشلوروكوككوس. بعد فوتوبليتشينج، أوتوفلوريسسينسي من بروتشلوروكوككوس يتم تقليل فعالية حتى يمكن تنفيذ تلك العاصفة بدقة أفقية ~ 10 نانومتر. باستخدام هذا الأسلوب، ونحن اكتساب المنظمة في فيفو ثلاثية الأبعاد (3-D) من البروتين فتسز وتميز أربعة مورفولوجيس عصابة فتسز مختلفة خلال دورة الخلية بروتشلوروكوككوس. ويمكن اعتماد الأسلوب يصف لنا هنا لتصوير القرار فائقة للكائنات الحية الأخرى التمثيل الضوئي.
Introduction
ميكروسكوبيس القرار فائقة يمكن كسر الحد حيود الضوء وتوفير الصور ضمن قرارات حيود الفرعية (< 200 nm). قد استخدمت على نطاق واسع في العديد من الكائنات الحية لدراسة البروتين التعريب والهياكل سوبسيلولار. الرئيسية فائقة القرار تشمل أساليب الفحص المجهري منظم إضاءة مجهرية (SIM)، وحفز الانبعاثات استنفاد مجهرية (STED) والعاصفة فوتواكتيفاتيد التعريب مجهرية (النخيل). الآليات والتطبيقات هذه القرار فائقة المجاهر وقد استعرضت في أماكن أخرى1،2.
العاصفة يمكن التوصل إلى قرار يصل إلى 10 نانومتر بالفصل المكاني3،4. للعاصفة، يتم تنشيط جزيء واحد فقط داخل منطقة حيود محدودة (“في”) ويتم الاحتفاظ بباقي الجزيئات المعطل (“إيقاف”). بتراكم للتبديل السريع على–والخروج من الجزيئات واحدة، يمكن أن تكون صورة “حيود غير محدود” ولدت3. ومن ناحية أخرى، قابلة للتطبيق في العاصفة، والسماح بترقية سهلة من الفحص المجهري الفلورية العادية للفحص المجهري عالية الدقة5،6أنواع كثيرة من الأصباغ العضوية والبروتينات الفلورية.
العاصفة لم تطبق على نطاق واسع في الخلايا التمثيل الضوئي، مثل البكتيريا، الطحالب، والخلايا النباتية مع المعايشة7،8، وهو يرجع ذلك إلى حقيقة أن العاصفة يتطلب كثافة الليزر عالية إلى فوتوسويتشينج بالسيارة. الليزر عالية الكثافة ظالم يثير الخلفية أوتوفلوريسسينسي قوية في خلايا التمثيل الضوئي ويتداخل مع التعريب جزيء واحد في تصوير العاصفة. من أجل استخدام العاصفة إلى التحقيق فيها الهياكل سوبسيلولار أو تفاعلات البروتين في خلايا التمثيل الضوئي، قمنا بتطوير بروتوكول فوتوبليتشينج لإخماد إشارات أوتوفلوريسسينسي الخلفية9. في إجراءات روتينية المصبوغة إيمونوفلوريسسينت، تتعرض العينات للضوء الأبيض كثافة عالية خلال الخطوة الحظر، مما يقلل من أوتوفلوريسسينسي الخلايا التمثيل الضوئي لتلبية المتطلبات للعاصفة. وهكذا، هذا البروتوكول يجعلها ممكنة التحقيق في الكائنات الحية المصطبغة بالعاصفة.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول استخدام العاصفة بصورة منظمة عصابة فتسز في بيكوسيانوباكتيريوم أحادي الخلية بروتشلوروكوككوس. FtsZ هو بروتين cytoskeletal مصانة عالية مثل tubulin الذي بوليميريزيس لتشكيل هيكل الدائري (الطوق Z) حول محيط الخلية10 وهو ضروري ل انقسام الخلية11. الحفاظ على بروتشلوروكوككوس الخلايا فوتوبليتشيد الأولى للحد من الخلفية أوتوفلوريسسينت وإيمونوستينيد مع جسم FtsZ مكافحة الأولية، وثم جسم مفتش (H + L) المضادة أرنب ثانوية مترافق مع فلوروفوري (مثلاً ، أليكسا فلور 750). في نهاية المطاف، يتم استخدام العاصفة لمراقبة المنظمات خاتم فتسز مفصلة في بروتشلوروكوككوس خلال مراحل مختلفة من دورة الخلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن الموصوفة في هذا البروتوكول، على إجراء خفض كبير في أوتوفلوريسسينسي سيانوباكتيريوم بروتشلوروكوككوس (الشكل 3)، وبعد ذلك، إيمونوستين البروتينات في الخلايا، مما مكننا من الاستفادة من العاصفة دراسة فتسز ثلاثي الأبعاد خاتم مورفولوجيس في بروتشلوروكوككوس (<strong class="…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون شو داييينج لها المساعدة التقنية والتعليقات على المخطوطة. ويدعم هذه الدراسة المنح المقدمة من “مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية” (المشروع رقم 41476147) و “مجلس منح البحوث” “منطقة هونغ كونغ الإدارية الخاصة”، الصين (المشروع رقم 689813 و 16103414).
Materials
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
Referenzen
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A New Wave of Cellular Imaging. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 285-314 (2010).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods Methods. 8 (12), 1027-1036 (2012).
- Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution Microscopy in Plant Cell Imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
- Schubert, V. Super-resolution Microscopy – Applications in Plant Cell Research. Frontiers in Plant Science. 8, 531 (2017).
- Liu, R., et al. Three-Dimensional Superresolution Imaging of the FtsZ Ring during Cell Division of the Cyanobacterium Prochlorococcus. mbio. 8 (6), e00657 (2017).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial cell division: assembly, maintenance and disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7, 642-653 (2009).
- Boer, P. A. Advances in understanding E. coli cell fission. Current Opinion in Microbiology. 13 (6), 730-737 (2010).
- Moore, L. R., Post, A. F., Rocap, G., Chisholm, S. W. Utilization of different nitrogen sources by the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Limnology and Oceanography. 47 (4), 989-996 (2002).
- Zhao, T., et al. A user-friendly two-color super-resolution localization microscope. Optics Express. 23 (2), 1879 (2015).
- Henriques, R., Lelek, M., Fornasiero, E. F., Valtorta, F., Zimmer, C., Mhlanga, M. M. QuickPALM: 3D real-time photoactivation nanoscopy image processing in ImageJ. Nature Methods. 7 (5), 339-340 (2010).
- Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ. BMC Bioinformatics. 11, 274 (2010).
- Ting, C. S., Rocap, G., King, J., Chisholm, S. W. Cyanobacterial photosynthesis in the oceans: The origins and significance of divergent light-harvesting strategies. Trends in Microbiology. 10 (3), 134-142 (2002).
- Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: The structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
- Morel, A., Ahn, Y. -. H., Partensky, F., Vaulot, D., Claustre, H. Prochlorococcus and Synechococcus – a Comparative-Study of Their Optical-Properties in Relation To Their Size and Pigmentation. Journal of Marine Research. 51, 617-649 (1993).
- Holden, S. J., Pengo, T., Meibom, K. L., Fernandez, C., Collier, J., Manley, S. High throughput 3D super-resolution microscopy reveals Caulobacter crescentusin vivo Z-ring organization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (12), 4566-4571 (2014).
- Zhao, M., Wei, B., Chiu, D. T. Imaging multiple biomarkers in captured rare cells by sequential immunostaining and photobleaching. Methods. 64 (2), 108-113 (2013).
- Golcuk, K., Mandair, G. S., Callender, A. F., Sahar, N., Kohn, D. H., Morris, M. D. Is photobleaching necessary for Raman imaging of bone tissue using a green laser?. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (7), 868-873 (2006).
- Haxo, F. T., Blinks, L. R. Photosynthetic Action Spectra of Marine Algae. The Journal of General Physiology. 33 (4), 389-422 (1950).
- Bryant, D. A. Phycoerythrocyanin and Phycoerythrin: Properties and Occurrence in Cyanobacteria. Journal of General Microbiology. 128 (4), 835-844 (1982).
