Immunofluoreszenz ermöglicht Höchstauflösung Bildgebung des FtsZ Ring in Cyanobacterium Prochlorococcus
Summary
Hier beschreiben wir eine Immunofluoreszenz-Methode, um die Autofluoreszenz der Cyanobakterien zu reduzieren. Nach Immunofluoreszenz wird stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie verwendet, um dreidimensionale Höchstauflösung Bilder der Cyanobakterien FtsZ Ring zu erhalten.
Abstract
Höchstauflösung Mikroskopie hat am meisten benutzt, um Protein-Interaktionen und subzelluläre Strukturen in vielen Organismen zu studieren. In photosynthetischen Organismen ist die laterale Auflösung des Super-Auflösung jedoch nur ~ 100 nm. Die geringe Auflösung ist vor allem aufgrund des hohen Autofluoreszenz Hintergrundes der photosynthetischen Zellen verursacht durch hochintensive Laser, die für die Super-Resolution Imaging, wie stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (Sturm) erforderlich sind. Hier beschreiben wir eine Immunofluoreszenz-gestützte Sturm Methode, die entwickelt wurde vor kurzem für die marine Picocyanobacterium Prochlorococcusimaging. Nach Immunofluoreszenz, die Autofluoreszenz Prochlorococcus wird effektiv reduziert, sodass dieser Sturm mit einer lateralen Auflösung von ~ 10 erfolgen kann nm. Mit dieser Methode wir die Organisation in Vivo dreidimensionale (3D), der das Protein FtsZ erwerben und vier verschiedene FtsZ Ring Morphologien während des Zellzyklus Prochlorococcuscharakterisieren. Die Methode, die wir hier beschreiben könnte für die Super-Resolution Imaging anderer photosynthetischen Organismen verabschiedet werden.
Introduction
Super-Resolution Microscopies können brechen die Beugungsgrenze des Lichts und Bilder innerhalb Sub Beugung Auflösungen (< 200 nm). Sie haben in vielen Organismen verbreitet, um Protein-Lokalisierung und subzelluläre Strukturen zu studieren. Großen Höchstauflösung Mikroskopieverfahren umfassen strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM), stimulierte Emission Depletion Mikroskopie (STED), Sturm und photoaktiviert Lokalisierung Mikroskopie (PALM). Die Mechanismen und Anwendungen diese Super-Resolution Mikroskope wurden überprüft an anderer Stelle1,2.
Sturm erreichen eine Auflösung bis zu 10 nm durch räumliche Trennung3,4. Für Sturm nur ein Molekül in einer Beugung begrenzte Region (“on”) aktiviert ist und der Rest der Moleküle sind inaktivierte (“off”) gehalten. Durch eine Anhäufung der schnellen ein- und – Ausschalten einzelner Moleküle kann ein “Beugung-unlimited” Bild generierten3sein. Inzwischen sind viele Arten von organischen Farbstoffen und fluoreszierende Proteine anwendbar im Sturm, so dass ein einfaches Upgrade von regelmäßigen Fluoreszenzmikroskopie hochauflösender Mikroskopie5,6.
Sturm ist nicht weit in den photosynthetischen Zellen, wie z. B. Cyanobakterien, Algen, angewendet und pflanzlichen Zellen mit Chloroplasten7,8, die aufgrund der Tatsache, dass Sturm ist erfordert hohe Laserintensität auf Laufwerk Photoswitching. Hochintensive Laser ungünstig reizt stark Autofluoreszenz Hintergrund in photosynthetischen Zellen und stört die Einzelmolekül-Lokalisierung in der Sturm-Bildgebung. Um mit Sturm der subzellulären Strukturen oder Protein-Interaktionen in photosynthetischen Zellen untersuchen, entwickelten wir ein Immunofluoreszenz-Protokoll, um den Hintergrund Autofluoreszenz Signale9zu stillen. In eine Routine immunofluorescent Färbeverfahren sind Exemplare weißes Licht von hoher Intensität während der Blockierungsschritt ausgesetzt, die die Autofluoreszenz des photosynthetischen Zellen zu den Anforderungen für Sturm senkt. So, dieses Protokoll macht es möglich, pigmentierte Organismen mit Sturm zu untersuchen.
Hier beschreiben wir das Protokoll Sturm zu verwenden, um die FtsZ Ring-Organisation in der einzelligen Picocyanobacterium ProchlorococcusBild. FtsZ ist ein hoch konservierte Tubulin-ähnliche Zellskelett Protein die polymerisiert um eine Ringstruktur (Z-Ring) um den Umfang einer Zelle10 zu bilden und ist wichtig für die Zellteilung11. Erhalten Prochlorococcus Zellen sind die ersten Photobleached zur Verringerung der Autofluorescent Hintergrund und Immunostained mit einem primären Anti-FtsZ Antikörper, und dann eine Sekundärantikörper Anti-Kaninchen-IgG (H + L) ist mit einem Fluorophor konjugiert (z.B. , Alexa Fluor 750). Schließlich wird Sturm verwendet, um die detaillierte FtsZ Ring Organisationen in Prochlorococcus in verschiedenen Zellzyklus Phasen zu beobachten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll beschrieben wir ein Verfahren um die Autofluoreszenz des Cyanobacterium Prochlorococcus (Abbildung 3) deutlich zu reduzieren und dann Immunostain der Proteine in den Zellen, die ermöglicht, Sturm um die 3-d-FtsZ studieren nutzen Ring-Morphologien in Prochlorococcus (Abbildung 4). Dieses Protokoll könnte für Super-Resolution Imaging in anderen photosynthetischen Organismen verabschiedet werden.
…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken für ihre technische Unterstützung und kommentiert das Manuskript Daiying Xu. Diese Studie stützt sich auf Zuschüsse aus der National Natural Science Foundation of China (Projektnummer 41476147) und der Forschung gewährt Rat von der Hong Kong Special Administrative Region, China (Projekt-Nummern 689813 und 16103414).
Materials
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
Referenzen
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