光漂白可实现前列腺素球菌中 ftsz 环的超分辨率成像
Summary
在这里, 我们描述了一种光漂白方法, 以减少蓝藻的自体荧光。光漂白后, 采用随机光学重建显微镜获得蓝藻 ftsz 环的三维超分辨率图像。
Abstract
超分辨显微镜已被广泛用于研究许多生物体的蛋白质相互作用和亚细胞结构。然而, 在光合生物中, 超分辨率成像的横向分辨率仅为 ~ 100 纳米。低分辨率的主要原因是光合细胞的高自体荧光背景, 这是由高强度激光引起的, 而超强分辨率成像需要这些激光, 如随机光学重建显微镜 (storm)。在这里, 我们描述了一种光浸辅助 storm 方法, 该方法是最近开发的用于海洋皮亚星杆菌的成像。光漂白后, 有效地降低了红球菌的自体荧光, 使 storm 能够在横向分辨率 ~ 10 纳米的情况下进行。利用该方法, 我们获得了 ftsz 蛋白的体内三维 (三维) 组织, 并在红球菌的细胞周期中表征了四种不同的 ftsz 环形态。我们在这里描述的方法可以用于其他光合生物的超分辨率成像。
Introduction
超分辨率显微镜可以打破光的衍射极限, 并在亚衍射分辨率 (& lt; 200 nm) 内提供图像。它们已被广泛用于许多生物体的蛋白质定位和亚细胞结构的研究。主要的超分辨率显微镜方法包括结构照明显微镜 (sim)、受刺激的发射耗尽显微镜 (sted)、storm 和光激活定位显微镜 (palm)。这些超分辨率显微镜的机理和应用在其他地方已经审查了 1,2。
storm 可以通过空间分离3,4实现高达10纳米的分辨率。对于 storm, 只有一个分子在衍射有限的区域内被激活 (“开”), 其余的分子被保持灭活 (“关闭”)。通过积累单个分子的快速开关, 可以生成一个 “衍射无限” 的图像 3.同时, storm 中还使用了多种有机染料和荧光蛋白, 使其易于从常规荧光显微镜升级到高分辨率显微镜5,6。
storm 在光合细胞中没有得到广泛的应用, 如蓝藻、藻类和叶绿体7, 8 的植物细胞, 这是因为 storm 需要较高的激光强度来驱动光致敏化。高强度激光在光合细胞中激发强自体荧光背景, 干扰 storm 成像中的单分子定位。为了利用 storm 研究光合细胞中的亚细胞结构或蛋白质相互作用, 我们开发了一种光漂白协议来抑制背景自体荧光信号9。在常规的免疫荧光染色过程中, 标本在封堵步骤中暴露在高强度的白光下, 从而降低光合细胞的自体荧光, 以满足 storm 的要求。因此, 该协议使得用 storm 研究色素生物成为可能。
在这里, 我们描述了使用 storm 来成像 ftsz 环组织在单细胞的五氯球菌的协议。ftsz 是一种高度保守的管状细胞骨架蛋白, 它聚合在细胞10的周长周围形成环状结构 (z 环), 对细胞分裂11至关重要.保鲜的红球菌细胞首先被光导, 以减少自荧光背景和免疫染色与初级抗 ftsz 抗体, 然后继发抗兔 igg (h + l) 抗体与荧光结合 (例如。, 亚历克沙·福鲁尔 750)。最终, storm 被用来观察不同细胞周期阶段的古氯球菌中的详细 ftsz 环组织。
Protocol
Representative Results
Discussion
在该协议中, 我们描述了一个程序, 以显著减少原蓝菌的自体荧光 (图 3c), 然后, 免疫抑制细胞中的蛋白质, 使我们能够利用 storm 来研究三维 ftsz在古氯球菌环形态(图 4)。该协议可用于其他光合生物的超分辨率成像。
以往对光合生物的研究主要是使用 sim 卡实现超分辨率成像, 因为 sim 不需要高强度的激光。然而, sim 的空…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢徐黛英对手稿的技术援助和评论。这项研究得到了中国国家自然科学基金 (项目编号 41476147) 和中国香港特别行政区研究资助局 (项目编号689813和 16103414) 的资助。
Materials
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
Referenzen
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