تعديل التوليف وبيوكونجوجيشن من الكواشف ثيول المتفاعلة لإنشاء الموقع بشكل انتقائي إيمونوكونجوجاتيس
Summary
في هذا البروتوكول، ونحن سوف تصف توليف القرون، كاشف المستندة إلى [سولفون] فينيوكساديازوليل الميثيل للمرفق الموقع انتقائية من الشحنات إلى ثيولس الجزيئات الحيوية، لا سيما الأجسام المضادة. وبالإضافة إلى ذلك، سوف يصف لنا التوليف وتوصيف تشيلاتور بيفونكشونال الحاملة لقرون وفي التصريف لجسم نموذجي.
Abstract
تم توظيف المسابير بيفونكشونال ماليميدي الحاملة لعقود لتعديل موقع انتقائية ثيولس في الجزيئات الحيوية، لا سيما الأجسام المضادة. بعد عرض يصرف على أساس ماليميدي المجراة في محدودية الاستقرار نظراً لأن الربط ثيوثير سوكسينيميديل يمكن الخضوع لرد فعل الرجعية-مايكل. هذا، بطبيعة الحال، يمكن أن يؤدي إلى الإفراج عن الحمولة المشعة أو تبادلها مع الجزيئات الحيوية ثيول الحاملة في الدورة الدموية. كل من هذه العمليات يمكن إنتاج تركيزات مرتفعة من النشاط في الأجهزة الصحية، فضلا عن تناقص النشاط التركيزات في الأنسجة المستهدفة، مما أدى إلى انخفاض التباين التصوير وانخفاض نسب العلاجية. في عام 2018، أبلغنا بإنشاء وحدات ومستقرة، والوصول إليها بسهولة فينيلوكساديازوليل الميثيل [سولفون] كاشف – التي يطلق عليها اسم ‘القرون’ – كمنصة بيوكونجوجيشنز على أساس ثيول. نحن أثبتت بوضوح أن بيوكونجوجيشنز الموقع الانتقائي القائم على القرون تكاثر وقوة إنشاء راديويمونوكونجوجاتيس متجانسة، محددة تحديداً جيدا وإيمونوريكتيفي عالية ومستقرة جداً. وعلاوة على ذلك، أظهرت التجارب الإكلينيكية في نماذج مورين لسرطان القولون والمستقيم هذه تسمية الموقع بشكل انتقائي راديويمونوكونجوجاتيس معرض الأداء المجراة في أعلى بكثير مقارنة بالأجسام المضادة راديولابيليد توليفها عبر المستندة إلى ماليميدي الاقتران. في هذا البروتوكول، ونحن سوف تصف التوليف أربع خطوات من القرون، إنشاء متغير قرون الحاملة بيفونكشونال من تشيلاتور في كل مكان DOTA (القرون-DOTA)، وتصريف القرون-DOTA إلى تراستوزوماب جسم استهداف HER2.
Introduction
منذ فترة طويلة وتستغل الانتقائية وخصوصية من الأجسام المضادة للمؤشرات الحيوية للأمراض لكلا التصوير النووي الكيمياء الصيدلانية واستهدف العلاج الإشعاعي1. ويستند نهج مشترك وبعيدا أكثر من راديولابيلينج الأجسام المضادة تمسك العشوائي راديولابيليد الاصطناعية المجموعات أو تشيلاتورس راديوميتال بالأحماض الأمينية – ليسينيس في أغلب الأحيان – داخل هيكل الغلوبولين المناعي ( الشكل 1A)2. أن هذه الاستراتيجية فعالة بالتأكيد، فطبيعتها العشوائية، غير محددة الموقع يمكن أن تخلق مشاكل. على وجه التحديد، إنتاج النهج التقليدي بيوكونجوجيشن سوء المعرفة وإيمونوكونجوجاتيس غير متجانسة تتألف من خليط آلاف ريجيويسوميرس مختلفة، كل مع مجموعتها الخاصة من الخصائص البيولوجية والدوائية3. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تعوق بيوكونجوجيشن عشوائي إيمونوريكتيفيتي من الأجسام المضادة إذا كانت الشحنة يتم إلحاقها مستضد ملزمة المجالات جسم.
على مر السنين، وضعت مجموعة متنوعة من استراتيجيات بيوكونجوجيشن الخاصة بالموقع والموقع الانتقائي من أجل معالجة هذه المشاكل4،5. الأكثر شيوعاً من هذه النهج يعتمد على الربط المسابر ماليميدي الحاملة لمجموعات سلفهيدريل سيستينيس (الشكل 1B). وبطبيعة الحال تحتوي الأجسام المضادة IgG1 4 ثنائي كبريتيد سلسلة بين الجسور والروابط التي يمكن الحد بشكل انتقائي تؤتي ثيولس الحرة يمكن أن تمر بتفاعلات إضافة مايكل مع ماليميديس شكل سندات ثيوثير سوكسينيميديل. استخدام ثيولس وماليميديس بالتأكيد تحسنا في الطرق التقليدية، ومجموعة متنوعة واسعة من تحمل ماليميدي سينثونس وتشيلاتورس بيفونكشونال متوفرة حاليا. ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن هذه المنهجية قد القيود الخطيرة، فضلا عن. إيمونوكونجوجاتيس على أساس ماليميدي يحمل المجراة في محدودية الاستقرار للربط ثيويثير يمكن الخضوع لرد فعل الرجعية-مايكل (الشكل 2)6،،من78،9، 10-وهذا، بطبيعة الحال، يمكن أن يؤدي إلى الإفراج عن الحمولة المشعة أو تبادلها مع الجزيئات الحيوية ثيول الحاملة في الدورة الدموية (على سبيل المثال، الجلوتاثيون أو الزلال). كل من هذه العمليات زيادة تركيزات النشاط في الأجهزة الصحية فضلا عن انخفاض النشاط التركيزات في الأنسجة المستهدفة، مما أدى إلى انخفاض التباين التصوير وانخفاض نسب العلاجية. وقد وضعت العديد من الكواشف ثيول المتفاعلة بديلة في محاولة للالتفاف حول هذه المسائل، بما في ذلك توسيلاتيس وبروم وأسيتيلس عودة، وينيل سولفونيس11،،من1213، 14 , 15 , 16 , 17. غير أن جميع هذه النهج بالقيود التي أعاقت تطبيقها على نطاق واسع.
قبل حوالي خمس سنوات المختبر الثالث بارباس كارلوس مساء في معهد أبحاث سكريبس رائدة استخدام فينيلوكساديازوليل الميثيل سولفونيس كالمواد الكاشفة لتشكيل روابط مستقرة جداً مع ثيولس (الشكل 1 والشكل 3) انتقائية 18 , 19-يعمل الكتاب البديل [سولفون] الحاملة الميثيل فينيلوكساديازوليل من فلوريسسين لتعديل عدة أجسام هندسيا لتحتوي على بقايا سيستين مجاناً، المنتجة إيمونوكونجوجاتيس في نهاية المطاف مع الاستقرار أعلى من مماثلة الثوابت التي تم إنشاؤها باستخدام المسابر المستندة إلى ماليميدي. عند رؤية هذا العمل واعدة، وقد فوجئنا إلى حد ما أن هذه التكنولوجيا قد استخدمت إلا نادراً في الكيمياء الإشعاعية ولم لم تستخدم على الإطلاق في تركيب تشيلاتورس بيفونكشونال أو راديويمونوكونجوجاتيس،من2021 . ندرة في هذه التطبيقات، ومع ذلك، سرعان ما بدأت بمعنى أكثر: أدت إلى عدة محاولات لشراء الكاشف من سيغما ألدريتش في تلقي الخلائط المعقدة من نواتج تحلل مع < 15 في المائة المجمع المطلوب. وباﻹضافة إلى ذلك، توليف الكاشف عن أنفسنا لم يكن خياراً واقعيا، أما الطريق الاصطناعية المنشورة مرهقة إلى حد ما وتتطلب معدات متطورة في مجال الكيمياء العضوية أن معظم الكيمياء الإشعاعية والتصوير الجزيئي مختبرات – بما في ذلك بلدنا – ببساطة لا تملك.
واستجابة لهذه العقبات، حددنا إنشاء الوصول إليها بسهولة ومستقرة جداً فينيلوكساديازوليل الميثيل [سولفون] كاشف التي يمكن الحصول عليها عبر مسار اصطناعية قوية ومعقولة السطحية. وفي وقت سابق من هذا العام، أبلغنا بإنشاء وحدات ومستقرة، والوصول إليها بسهولة فينيلوكساديازوليل الميثيل [سولفون] كاشف – يطلق عليها اسم ‘القرون’ – كمنصة بيوكونجوجيشنز على أساس ثيول (الشكل 1 والشكل 3)22. الاختلاف الرئيسي بين القرون والكاشف عنها بارباس، et al. أن السابق توظف عصابة الانيليني يعلق على مجموعة [سولفون] الميثيل فينيلوكساديازوليل، في حين أن هذا الأخير يتميز فينول في نفس الموضع (الشكل 4). يسهل هذا التغيير طريقا اصطناعية أكثر وضوحاً وأيسر منالاً كذلك – إذا كانت تجربتنا مع المجمع المتاحة تجارياً دلالة – كاشف نهائي أكثر استقرارا. في هذا العمل، ونحن أيضا توليف زوج من القرون الحاملة بيفونكشونال تشيلاتورس – DFO القرون والقرون-التايوانية-أ ”-دتبا-لتسهيل إنشاء 89Zr-و 177لو المسمى راديويمونوكونجوجاتيس، على التوالي. ونحن سوف نناقش، لقد أظهرنا أن بيوكونجوجيشنز الموقع الانتقائي القائم على القرون تكاثر وقوة إنشاء راديويمونوكونجوجاتيس متجانسة، محددة تحديداً جيدا وإيمونوريكتيفي عالية ومستقرة جداً. وعلاوة على ذلك، أظهرت التجارب الإكلينيكية في نماذج مورين لسرطان القولون والمستقيم هذه تسمية الموقع بشكل انتقائي راديويمونوكونجوجاتيس متفوقة الأداء المجراة في المعرض مقارنة بالأجسام المضادة راديولابيليد توليفها عبر المستندة إلى ماليميدي الاقتران.
والهدف الأسمى من هذا العمل تسهيل إنشاء إيمونوكونجوجاتيس محددة تحديداً جيدا ومتجانسة ومستقرة جداً وشديدة إيمونوريكتيفي للتطبيقات في المختبر والمجراه. النهج الاصطناعية بسيط يمكن أداؤها في أي مختبر، ويمكن تعديل الكاشف القرون الأصل مع عدد كبير من تشيلاتورس مختلفة أو فلوروفوريس أو الشحنات. في هذا البروتوكول والفيديو المصاحبة لها، ونحن سوف تصف توليف بسيطة من أربع خطوات من القرون (الشكل 5)؛ إنشاء متغير القرون الحاملة ليعطي، تشيلاتور تستخدم على نطاق واسع للتنسيق من 64Cu، 68Ga، 111، 177لو، و 225التيار المتردد (الشكل 6)؛ وبيوكونجوجيشن من القرون-DOTA على جسم نموذجي، استهداف HER2 IgG1 تراستوزوماب (الشكل 7).
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا التقرير، لقد اخترنا لا تتضمن أية بروتوكولات للتجريب راديولابيلينج أو المجراة. لدينا أسباب واضحة. فيما يتعلق بالمسألة الأولى، راديولابيلينج إيمونوكونجوجاتي المستندة إلى القرون لا تختلف في كل من إيمونوكونجوجاتي تصنيعه باستخدام استراتيجيات أخرى بيوكونجوجيشن، وكانت هذه الإجراءات ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الدكتور ساي كيران شارما للمحادثات مفيدة.
Materials
| 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol | Sigma-Aldrich | 675024 | |
| 1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube | Eppendorf | 925000090 | |
| 1.5 mL Microcentrifugal Tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | EN300000141G | |
| Cyclohexane | Fisher Scientific | C556-4 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC383780010 | |
| Diisopropylethylamine | MP Biomedicals, LLC | 150915 | |
| Dimethylsulfoxide | Fisher Scientific | 31-727-5100ML | |
| Ethyl Acetate | Fisher Scientific | E145 4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | |
| Magnesium Sulfate | Acros Organics | 413485000 | |
| m-chloroperbenzoic acid | Sigma-Aldrich | 273031 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 1 | |
| NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine | Sigma-Aldrich | 671401 | Store at -80 °C |
| N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 3450 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10× Concentration |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -80 °C |
| Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| TCEP | ThermoFischer Scientific | 20490 | |
| Triethylamine | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid | Fisher Scientific | A116-50 |
Referenzen
- Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
- Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
- Agarwal, P., Bertozzi, C. R. Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).
- Alley, S. C., et al. Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).
- Baldwin, A. D., Kiick, K. L. Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).
- Shen, B. -. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).
- Jackson, D., et al. In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates. Plos One. 9 (1), (2014).
- Ponte, J. F., et al. Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates. Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).
- Stimmel, J. B., et al. Site-specific conjugation on serine -> cysteine variant monoclonal antibodies. Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).
- Li, L., et al. Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody. Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).
- Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab’ fragment. Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).
- Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
- Li, L., et al. Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).
- Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -. w., Lever, R., Brocchini, S. Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).
- Koniev, O., Wagner, A. Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation. Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).
- Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers. Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).
- Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation. Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).
- Zhang, Q., et al. Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers. Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).
- Chiotellis, A., et al. Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions. Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).
- Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability. Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).
- Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).
- Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).
- Junutula, J. R., et al. Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index. Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).
- Pillow, T. H., et al. Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).
- Boswell, C. A., et al. Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).
- Boswell, C. A., et al. Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).
- Alvarez, V. L., et al. Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy. Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).
- Strop, P., et al. Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates. Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).
- Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. Antibody conjugates with unnatural amino acids. Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).
- Axup, J. Y., et al. Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).
- Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
- Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E. Periodate oxidation of methionine in proteines. Analytical Biochemistry. 126 (1), 183-189 (1982).
- Wang, W., et al. Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).
- O’Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties. Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).
- Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).
- Hu, M. D., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
