Синтез и Bioconjugation тиоловых реактивной реагентов для создания сайта выборочно изменять Immunoconjugates
Summary
В этом протоколе мы будем описывать синтез СТРУЧКИ, phenyoxadiazolyl метил на основе сульфона реагент для сайта селективные крепление грузов тиолы биомолекул, особенно антител. Кроме того мы будем описывать синтеза и характеристика бифункциональных хелатором СТРУЧКИ подшипника и его спряжение модель антитела к.
Abstract
Maleimide подшипник бифункциональных зонды были использованы на протяжении десятилетий для сайта селективные модификации тиолы в биомолекулы, особенно антител. Еще на основе maleimide конъюгатов отображения ограниченное стабильности в естественных условиях, потому что succinimidyl тиоэфиры связь может пройти ретро Майкл реакции. Это, конечно, может привести к выпуска радиоактивных полезных данных или обмена с биомолекулами тиоловых подшипник в обращении. Оба этих процессов может производить повышенной активности концентрации в здоровых органов, а также снижение активности концентрации в тканях-мишенях, обусловило уменьшение контрастность изображений и ниже терапевтические показатели. В 2018 году, мы сообщили создание модульный, стабильный и легко доступны phenyloxadiazolyl метил сульфона реагент — называли «СТРУЧКИ» — как платформы на базе тиоловых bioconjugations. Мы наглядно продемонстрировали, что на основе СТРУЧКИ сайт селективного bioconjugations можно воспроизвести и энергично создать однородную, четко определенных, весьма иммунореактивных и высокостабильных radioimmunoconjugates. Кроме того доклинические эксперименты в мышиных моделях колоректального рака показали, что эти сайт выборочно помечены radioimmunoconjugates выставка намного превосходят в естественных условиях производительности по сравнению с radiolabeled антитела синтезируются через на основе maleimide спряжения. В этом протоколе мы будем описывать четырехступенчатая синтез СТРУЧКИ, создание бифункциональных СТРУЧКИ подшипник вариант вездесущие хелатором DOTA (СТРУЧКИ-DOTA) и спряжение СТРУЧКИ-DOTA к трастузумаб HER2-таргетинг антитела.
Introduction
Радиофармацевтические химики давно эксплуатируемых избирательности и специфичность антител для биомаркеров болезни для обеих ядерных изображений и целевых радиотерапии1. Далеко и прочь наиболее общий подход к radiolabeling антител основывается на неизбирательное придание radiolabeled протезно групп или radiometal энтеросорбенты аминокислоты — наиболее часто lysines — в рамках структуры иммуноглобулина ( Рисунок 1A)2. Хотя эта стратегия является безусловно эффективным, его случайные, сайт неспецифический характер может создать проблемы. В частности традиционные bioconjugation подходы производят плохо определены и гетерогенных immunoconjugates состоит из смеси тысяч различных regioisomers, каждый со своим собственным набором биологических и фармакологические свойства3. Кроме того случайных bioconjugation могут препятствовать иммунореактивности антител, если груз добавляется иммуноглобулина антиген связывая доменов.
С годами разнообразные bioconjugation участкам и сайт селективные стратегии были разработаны с целью решения этих проблем4,5. Наиболее распространенные из этих подходов основывается на лигирование maleimide подшипник зондов сульфгидрильных групп, по которым (рис. 1B). IgG1 антитела естественно содержат 4 Интер цепи дисульфидных мостов, связей, которые могут быть выборочно сведены к дают бесплатные тиолы способных претерпевает Майкл реакции с малеинимидов в форме succinimidyl тиоэфиры облигаций. Использование тиолами и малеинимидов, безусловно, улучшение по сравнению с традиционными методами и широкий спектр maleimide подшипник синтонов и бифункциональных хелаторов в настоящее время доступны. Однако важно отметить, что эта методология имеет также серьезные ограничения. На основе Maleimide immunoconjugates выставку ограниченное стабильности в естественных условиях, потому что тиоэфиры связь может пройти ретро Майкл реакции (рис. 2)6,,78,9, 10. это, конечно, может привести к выпуска радиоактивных полезных данных или обмен с биомолекулами тиоловых подшипник в обращении (например, глутатион или альбумина в сыворотке крови). Оба из этих процессов можно увеличения концентрации деятельности в здоровых органов, а также уменьшение концентрации деятельности в тканях-мишенях, обусловило уменьшение контрастность изображений и ниже терапевтические показатели. Были разработаны несколько альтернативных тиоловых реактивной реагентов в попытке обойти эти проблемы, включая tosylates, bromo – и Иодо acetyls и винил сульфонов11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17. Однако все эти подходы имеют ограничения, которые препятствуют их широкое применение.
Около пяти лет назад, в лаборатории в конце Карлос Barbas III научно-исследовательском институте Скриппса пионером в использовании phenyloxadiazolyl метил сульфонов как реагенты для селективного формирования высокостабильных связей с тиолами (Рисунок 1 c и рис. 3) 18 , 19. авторы заняты phenyloxadiazolyl метил сульфон подшипник вариант флуоресцеин изменить несколько антител, спроектирован, чтобы содержать остатки свободной цистеина, в конечном счете производства immunoconjugates с более высокой стабильности, чем аналогичные конструкции, созданные с помощью датчиков на основе maleimide. Увидев этой перспективной работы, мы были несколько удивлены тем, что эта технология использовалась только вряд в радиохимии и еще не было вообще используется в синтезе бифункциональных хелаторов или radioimmunoconjugates20,21 . Эта нехватка приложений, однако, вскоре начал делать больше смысла: несколько попыток закупки реагент от Sigma-Aldrich привело к получения сложных смесей продуктов разложения с < 15% нужного соединения. Кроме того, обобщение сообщенных реагент себя был не является реалистичным вариантом либо, как опубликованные синтетических маршрут несколько громоздкой и требует сложных органической химии оборудование, большинство радиохимии и Молекулярное воображение лаборатории — включая ours — просто не обладают.
В ответ на эти препятствия мы намереваемся создать легко доступны и очень стабильной phenyloxadiazolyl метил сульфона реагент, который может быть получен через надежную и разумно снисходительный синтетических маршрут. Ранее в этом году, мы сообщили создание модульный, стабильный и легко доступны phenyloxadiazolyl метил сульфона реагент — называли «СТРУЧКИ» — как платформы на основе тиоловых bioconjugations (Рисунок 1 c и рис. 3)22. Ключевое различие между СТРУЧКИ и реагент сообщил Barbas, et al. является, что бывший использует анилин кольцо, прикрепленное к phenyloxadiazolyl метил сульфона остаток, в то время как последняя имеет фенола в таком же положении (рис. 4). Это изменение облегчает более простой и доступной синтетических маршрутов, а также — если наш опыт с коммерчески доступные соединения является символом — более стабильной окончательный реагент. В этой работе, мы также синтезируется пару СТРУЧКИ подшипник бифункциональных хелаторов — СТРУЧКИ-ДФО и СТРУЧКИ-CHX-A”-DTPA — содействовать созданию 89Zr – и 177Лу меченых radioimmunoconjugates, соответственно. Как мы будем обсуждать, мы продемонстрировали, что на основе СТРУЧКИ сайт селективного bioconjugations можно воспроизвести и энергично создать однородную, четко определенных, весьма иммунореактивных и высокостабильных radioimmunoconjugates. Кроме того доклинические эксперименты в мышиных моделях колоректального рака показали, что эти сайт выборочно помечены radioimmunoconjugates выставку Улучшенный в естественных условиях производительности по сравнению с radiolabeled антитела синтезируются через на основе maleimide спряжения.
Сквозные цель этой работы заключается в содействии созданию четко, однородной, очень стабильный и высоко иммунореактивных immunoconjugates для приложений в vitro и in vivo. Синтетический подход является достаточно простым, чтобы выполняться в почти любой лаборатории, и родитель СТРУЧКИ реагента могут быть изменены с множеством различных энтеросорбенты, флуорофоров или грузов. В этот протокол и сопровождающих видео мы будем описывать простые, четырехступенчатая синтез СТРУЧКИ (рис. 5); Создание СТРУЧКИ подшипник вариант DOTA, широко используемый хелатором для координации 64Cu, 68Ga, 111, 177Лу и 225переменного тока (рис. 6); и bioconjugation СТРУЧКИ-DOTA в модели антитела, трастузумаб HER2-таргетинг IgG1 (рис. 7).
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящем докладе мы решили не включать любые протоколы для radiolabeling или в естественных условиях экспериментов. Причины просты. Что касается первого, radiolabeling на основе СТРУЧКИ immunoconjugate не отличается от того из immunoconjugate, синтезируются с помощью других bioconjugation стратегии, и эти процедуры б…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят доктор Sai Kiran Шарма за полезные беседы.
Materials
| 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol | Sigma-Aldrich | 675024 | |
| 1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube | Eppendorf | 925000090 | |
| 1.5 mL Microcentrifugal Tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | EN300000141G | |
| Cyclohexane | Fisher Scientific | C556-4 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC383780010 | |
| Diisopropylethylamine | MP Biomedicals, LLC | 150915 | |
| Dimethylsulfoxide | Fisher Scientific | 31-727-5100ML | |
| Ethyl Acetate | Fisher Scientific | E145 4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | |
| Magnesium Sulfate | Acros Organics | 413485000 | |
| m-chloroperbenzoic acid | Sigma-Aldrich | 273031 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 1 | |
| NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine | Sigma-Aldrich | 671401 | Store at -80 °C |
| N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 3450 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10× Concentration |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -80 °C |
| Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| TCEP | ThermoFischer Scientific | 20490 | |
| Triethylamine | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid | Fisher Scientific | A116-50 |
Referenzen
- Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
- Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
- Agarwal, P., Bertozzi, C. R. Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).
- Alley, S. C., et al. Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).
- Baldwin, A. D., Kiick, K. L. Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).
- Shen, B. -. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).
- Jackson, D., et al. In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates. Plos One. 9 (1), (2014).
- Ponte, J. F., et al. Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates. Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).
- Stimmel, J. B., et al. Site-specific conjugation on serine -> cysteine variant monoclonal antibodies. Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).
- Li, L., et al. Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody. Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).
- Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab’ fragment. Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).
- Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
- Li, L., et al. Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).
- Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -. w., Lever, R., Brocchini, S. Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).
- Koniev, O., Wagner, A. Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation. Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).
- Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers. Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).
- Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation. Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).
- Zhang, Q., et al. Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers. Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).
- Chiotellis, A., et al. Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions. Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).
- Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability. Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).
- Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).
- Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).
- Junutula, J. R., et al. Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index. Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).
- Pillow, T. H., et al. Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).
- Boswell, C. A., et al. Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).
- Boswell, C. A., et al. Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).
- Alvarez, V. L., et al. Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy. Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).
- Strop, P., et al. Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates. Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).
- Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. Antibody conjugates with unnatural amino acids. Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).
- Axup, J. Y., et al. Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).
- Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
- Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E. Periodate oxidation of methionine in proteines. Analytical Biochemistry. 126 (1), 183-189 (1982).
- Wang, W., et al. Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).
- O’Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties. Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).
- Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).
- Hu, M. D., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
