Synthese und Biokonjugaten der Thiol-reaktive Reagenzien für die Erstellung der Website selektiv geändert Immunokonjugate

Summary

In diesem Protokoll wird die Synthese von Hülsen, ein Phenyoxadiazolyl Methyl Sulfon-basierte Reagenz für die Website-selektive Befestigung der Ladungen an die Thiole von Biomolekülen, insbesondere Antikörper beschrieben. Darüber hinaus beschreiben wir die Synthese und Charakterisierung von eine Hülsen tragenden bifunktionelle Chelator und die Konjugation zu einem Modell-Antikörper.

Abstract

Maleimide-Lager bifunktionelle Sonden sind seit Jahrzehnten für die Website-gezielte Modifizierung der Thiole in Biomolekülen, insbesondere Antikörper eingesetzt worden. Noch angezeigt Maleimide-basierte Konjugate begrenzten Stabilität in-vivo, da Succinimidyl-Thioether-Gestänge eine Retro-Michael-Reaktion unterzogen werden kann. Dies, führt natürlich zur Freisetzung von radioaktiven Nutzlast oder deren Austausch mit Thiol-Lager Biomoleküle im Umlauf. Beide Prozesse können erhöhte Aktivitätskonzentrationen in gesunde Organe produzieren sowie Aktivitätskonzentrationen in Zielgeweben, was zu reduzierten bildgebenden Kontrast und niedrigere therapeutische Werte gesunken. Wir berichteten im Jahr 2018, die Schaffung eines Modular, stabil und leicht zugängliche Phenyloxadiazolyl Methyl Sulfon Reagenz – genannt “PODS” – als Plattform für Thiol-basierten Bioconjugations. Wir haben klar gezeigt, dass PODS-basierte Website-selektive Bioconjugations reproduzierbar und robust homogen, klar definierte hoch immunreaktiven und hochstabiler Radioimmunoconjugates erstellen. Darüber hinaus haben präklinische Experimenten in murinen Modellen von kolorektalen Karzinomen gezeigt, dass diese Website selektiv Radioimmunoconjugates Ausstellung weit überlegen in-vivo-Leistung im Vergleich zu radioaktiven Antikörper synthetisiert über Maleimide-basierte beschriftet Konjugationen. In diesem Protokoll werden wir die vier-Stufen-Synthese von Hülsen, die Schaffung einer bifunktionelle Hülsen tragenden Variante des allgegenwärtigen Chelator DOTA (PODS-DOTA) und die Konjugation des PODS-DOTA, die HER2-targeting Antikörper Trastuzumab beschreiben.

Introduction

Radiopharmazeutischen Chemiker haben lange ausgenutzt, die Selektivität und Spezifität der Antikörper nach Biomarkern der Krankheit für die beiden nuklearen Bildgebung und gezielte Strahlentherapie¹. Abstand der häufigste Ansatz für die enzymatische Antikörper gründet sich auf die wahllose Befestigung des radioaktiven prosthetischen Gruppen oder Radiometal Chelatoren an Aminosäuren – meist Lysines – innerhalb der Struktur von Immunglobulin ( Abbildung 1A)². Während diese Strategie sicherlich wirksam ist, kann naturgemäß zufällige, nicht-Site-spezifische Probleme verursachen. Insbesondere traditionelle Biokonjugaten Ansätze zu produzieren, schlecht definiert und heterogenen Immunokonjugate bestehend aus Mischungen von Tausenden von verschiedenen Regioisomeren, jeweils mit einem eigenen Satz von biologischen und pharmakologischen Eigenschaften³. Darüber hinaus kann zufällige Biokonjugaten Immunoreactivity von Antikörpern behindern, wenn die Ladung an der Immunglobulin Antigen-bindenden Domänen angehängt wird.

Im Laufe der Jahre eine Vielzahl von standortspezifischen und Website-selektive Biokonjugaten Strategien wurden entwickelt, um diese Probleme^4,5ansprechen. Die häufigste dieser Ansätze stützt sich auf die Unterbindung der Maleimide tragenden Sonden, um die Sulfhydryl-Gruppen von Cysteine (Abbildung 1 b). IgG1-Antikörper enthalten von Natur aus 4 Inter Kette Disulfidbrücken, Verbindungen, die gezielt reduziert werden können, um in der Lage, Michael Hinzufügung Reaktionen mit Maleimides Succinimidyl Thioether Anleihen bilden derzeit kostenlos Thiole zu erbringen. Die Verwendung von Thiole und Maleimides ist sicherlich eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen Methoden und eine Vielzahl von Maleimide tragenden Synthone und bifunktionelle Chelatoren sind derzeit verfügbar. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Methode auch gravierende Einschränkungen hat. Maleimide-basierte Immunokonjugate aufweisen begrenzten Stabilität in-vivo, da Thioether Gestänge ein Retro-Michael-Reaktion (Abbildung 2)^6,7,8,9, unterziehen kann ¹⁰., natürlich kann dies zur Freisetzung von radioaktiven Nutzlast oder deren Austausch mit Thiol-Lager Biomoleküle im Umlauf (z. B. Glutathion oder Serum-Albumin). Beide Prozesse können die Aktivitätskonzentrationen in gesunde Organe zu erhöhen sowie die Aktivitätskonzentrationen in Zielgeweben, was zu reduzierten bildgebenden Kontrast und niedrigere therapeutische Werte zu verringern. Mehrere alternative Thiol-reaktive Reagenzien sind entwickelt worden, in dem Bemühen, diese Fragen, namentlich Tosylates, Bromo und Iodo-Acetyl- und Vinyl Sulfonen^11,12,13, zu umgehen ^{14 , 15 , 16 , 17}. all diese Ansätze haben jedoch Einschränkungen, die ihre breite Anwendung behindert haben.

Vor fünf Jahren Pionier das Labor des späten Carlos Barbas III am Scripps Research Institute im Einsatz von Phenyloxadiazolyl Methyl Sulfonen als Reagenzien für die selektive Bildung von sehr stabile Verbindungen mit Thiole (Abbildung 1 und Abbildung 3) ^{18 , 19}. die Autoren beschäftigt eine Phenyloxadiazolyl Methyl Sulfon-Lager Variante von Fluorescein, mehrere Antikörper entwickelt, um kostenlose Cystein Rückstände zu ändern Immunokonjugate letztlich höhere Stabilität als analog zu produzieren Konstruktionen mit Maleimide-basierte Sonden erstellt. Beim Anblick dieses vielversprechende Arbeit, waren wir etwas überrascht, dass diese Technologie nur kaum in Radiochemie verwendet worden hatte und noch nicht wurde überhaupt in der Synthese von bifunktionelle Chelatoren oder Radioimmunoconjugates^{20,21 verwendet hatte} . Dieser Mangel an Anwendungen, jedoch bald fing an, mehr Sinn machen: mehrere Versuche zur Beschaffung von Reagenz von Sigma-Aldrich führte bei der Auszahlung der komplexe Mischungen von Zersetzungsprodukten mit < 15 % der gewünschten Verbindung. Darüber hinaus Synthese der gemeldeten Reagenz selbst war keine realistische Option, da die veröffentlichten Syntheseweg etwas umständlich ist und anspruchsvolle organische Chemie Geräte erfordert, die meisten Radiochemie und molekulare Bildgebung Labors – einschließlich der unsrigen — einfach nicht besitzen.

In Reaktion auf diese Hindernisse brachen wir erstellen eine leicht zugängliche und hochstabiles Phenyloxadiazolyl Methyl Sulfon Reagenz, der über einen robusten und relativ einfache Syntheseweg erzielt werden kann. Anfang des Jahres berichteten wir die Schaffung eines Modular, stabil und leicht zugängliche Phenyloxadiazolyl Methyl Sulfon Reagenz – genannt “PODS” – als Plattform für Thiol-basierte Bioconjugations (Abbildung 1 und Abbildung 3)²². Der wesentliche Unterschied zwischen Hülsen und das Reagenz von Barbas, berichtet ist Et Al., dass ersteres einen Anilin Ring befestigt Phenyloxadiazolyl Methyl Sulfon glyko-beschäftigt, während letztere verfügt über ein Phenol in der gleichen Position (Abbildung 4). Diese Änderung ermöglicht eine einfache und zugängliche Syntheseweg sowie – wenn unsere Erfahrung mit den im Handel erhältlichen Verbindung emblematischen ist — ein stabiler endgültige Reagenz. In dieser Arbeit haben wir auch ein paar Hülsen tragenden bifunktionelle Chelatoren synthetisiert — Hülsen-DFO und Hülsen-CHX-A”-DTPA – die Schaffung von ⁸⁹Zr- und ¹⁷⁷Lu-mit der Bezeichnung Radioimmunoconjugates bzw. zu erleichtern. Wie wir diskutieren werden, haben wir bewiesen, dass PODS-basierte Website-selektive Bioconjugations reproduzierbar und robust homogen, klar definierte hoch immunreaktiven und hochstabiler Radioimmunoconjugates erstellen. Darüber hinaus haben präklinische Experimenten in murinen Modellen von kolorektalen Karzinomen gezeigt, dass diese Website selektiv Radioimmunoconjugates Ausstellung in-vivo Höchstleistungen im Vergleich zu radioaktiven Antikörper synthetisiert über Maleimide-basierte beschriftet Konjugationen.

Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist die Erstellung von klar definierten, homogene, hochstabile und hoch immunreaktiven Immunokonjugate für in-vitro- und in-vivo Anwendungen zu erleichtern. Der synthetischen Ansatz ist einfach genug, um in fast jedem Labor durchgeführt werden, und das übergeordnete PODS Reagenz kann mit einer Vielzahl von verschiedenen Chelatoren, Fluorophore oder Ladungen geändert werden. In diesem Protokoll und das dazugehörige Video beschreiben wir die einfache, vierstufiges Synthese von Hülsen (Abbildung 5); die Schaffung einer Hülsen tragenden Variante von DOTA, eine weit verbreitete Chelator für die Koordinierung der ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga ¹¹¹In ¹⁷⁷Lu und ²²⁵Ac (Abbildung 6); und die Biokonjugaten von Hülsen-DOTA an einem Modell Antikörper, die HER2-targeting IgG1 Trastuzumab (Abbildung 7).

Protocol

(1) die Synthese von 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1) Hinweis: Aufgrund der Lichtempfindlichkeit der Verbindung, halten Sie alle Reaktionen in Gefäßen mit Folie abgedeckt. In einer 10 mL Runde untere Kolben, 100 mg (0.517 Mmol, 1 Äquivalent) 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol in 3 mL Methanol auflösen. Diese Projektmappe hinzufügen 360 μL der Diisopropylethylamine (DIPEA; 2,07 Mmol; 4 Entsprechungen; wasserfrei) und eine kleine magnetische S…

Representative Results

Die ersten vier Schritte dieses Protokolls – die Synthese der Hülsen – wurden entwickelt, um robust und zuverlässig. Die Deprotonierung und Substitution von 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol bilden die gewünschte Thioether-Produkt bietet die Thioether in > 99 % Ausbeute nach nur 45 Minuten. Als nächstes wurde der Ligatur zwischen 1 und N-Boc-N’-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine über ein standard-Peptid Kupplung Verfahren, mit dem Ergebnis in d…

Discussion

In diesem Bericht haben wir uns entschieden, keine Protokolle für enzymatische oder in vivo Experimente beinhalten. Unsere Gründe sind einfach. In Bezug auf erstere, die enzymatische ein PODS-basierte Immunoconjugate unterscheidet sich nicht überhaupt von derjenigen einer Immunoconjugate synthetisiert, mit anderen Biokonjugaten-Strategien, und diese Verfahren wurden umfassend überprüft anderswo² . In Bezug auf Letzteres können die Besonderheiten der präklinischen in-vivo-Experimente (d. h. …

Materials

5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol	Sigma-Aldrich	675024
1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube	Eppendorf	925000090
1.5 mL Microcentrifugal Tube	Fisherbrand	05-408-129
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-4
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit	EMD Millipore	EN300000141G
Cyclohexane	Fisher Scientific	C556-4
Dichloromethane	Fisher Scientific	AC383780010
Diisopropylethylamine	MP Biomedicals, LLC	150915
Dimethylsulfoxide	Fisher Scientific	31-727-5100ML
Ethyl Acetate	Fisher Scientific	E145 4
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-500
Iodomethane	Sigma-Aldrich	289566-100G
Magnesium Sulfate	Acros Organics	413485000
m-chloroperbenzoic acid	Sigma-Aldrich	273031
Methanol	Fisher Scientific	A412 1
NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine	Sigma-Aldrich	671401	Store at -80 °C
N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride	Sigma-Aldrich	3450
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P5493	10× Concentration
p-SCN-Bn-DOTA	Macrocyclics	B-205	Store at -80 °C
Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns	GE Healthcare	17085101
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	S7795
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-1
TCEP	ThermoFischer Scientific	20490
Triethylamine	Fisher Scientific	AC157911000
Trifluoroacetic Acid	Fisher Scientific	A116-50