ניתוח כמותי של הרכב הסלולר בנגעים טרשת עורקים מתקדמת של שריר חלק תא שושלת היוחסין-עקיבה עכברים
Summary
אנו מציעים פרוטוקול מתוקננים כדי לאפיין את ההרכב הסלולר של נגעים טרשת עורקים מאתר בשלב מאוחר, כולל שיטות שיטתית של דיסקציה בעלי חיים, רקמות הטבעה, חלוקתה, מכתים, וניתוח של העורקים brachiocephalic מ atheroprone שריר חלק תא שושלת היוחסין עקיבה עכברים.
Abstract
טרשת עורקים נשאר הגורם המוביל למוות ברחבי העולם, ו, למרות אינספור מחקרים פרה המתאר מטרות טיפולית מבטיחה, התערבויות הרומן נשארו חמקמק. זה כנראה נובע, בין השאר, ההסתמכות על מודלים למניעת פרה חוקרת את ההשפעות של שינויים גנטיים או טיפולי תרופתי על התפתחות טרשת עורקים ולא המחלה הוקמה. בנוסף, תוצאות של מחקרים אלה הן לעתים קרובות מבלבלים עקב השימוש של ניתוחים הנגע שטחית וחוסר אפיון אוכלוסיות תאים הנגע. כדי לסייע להתגבר על מכשולים translational אלה, אנו מציעים של הסתמכות מוגברת על מודלים של התערבות שמעסיקים חקירה של שינויים בהרכב הסלולר ברמה תא בודד על ידי צביעת immunofluorescent קונפוקלית. לשם כך, אנו מתארים פרוטוקול לבדיקה סוכן טיפולית בשם מודל התערבות מאתר כולל בגישה שיטתית לנתיחה בעלי חיים, הטבעה, חלוקתה, מכתים של כימות של העורק brachiocephalic נגעים. בנוסף, בשל המגוון פנוטיפי של תאים בתוך התרדמה בשלב מאוחר, נתאר את החשיבות של שימוש שושלת היוחסין הספציפי תא, inducible עקיבה העכבר מערכות, כיצד זה ניתן למנף מוטים פלואורסנציה אוכלוסיות תאים הנגע טרשת עורקים. יחד, אסטרטגיות אלו עשוי לסייע ביולוגים וסקולרית דגם התערבויות טיפוליות ולנתח באופן מדויק יותר מחלות טרשת עורקים, בתקווה יתרגם לתוך שיעור גבוה יותר של הצלחה בניסויים קליניים.
Introduction
טרשת עורקים הוא הגורם המוביל של התחלואה והתמותה ברחבי העולם הבסיסית הרוב המכריע של מחלת עורקים כללית, מחלות עורקים היקפיים, שבץ מוחי. טרשת עורקים כלילית בשלב מאוחר יכול לגרום סיבוכים חמורים, כולל חשבונאות אוטם שריר הלב כמעט 16% של העולם אוכלוסייה התמותה1,2. בשל ההשפעה ההרסנית שלו על בריאות הציבור, הפך מאמץ ניכר כדי לפענח את מנגנוני נהיגה התקדמות טרשת עורקים, וכן גם לפתח אסטרטגיות טיפוליות מקוריות. ובכל זאת, שיעור הסבירות של האישור (LOA) של ניסויים קליניים למחלות לב וכלי דם הוא בין הנמוכים ביותר בהשוואה לשדות קליניים אחרים (רק 8.7% עבור שלב I)3. זו יכולה להיות מוסברת בחלקה על ידי מחסומים רבים טרשת עורקים הזה מהווה לפיתוח תרופה יעילה כולל את הטבע כמעט בכל מקום, התקדמות קלינית-שקט, והטרוגניות מחלה משמעותית. יתר על כן, העיצוב שיוצרת של מחקרים שנעשו בבעלי חיים פרה יכולה גם להיות אחראים חוסר הצלחה בתרגום רפואי. באופן ספציפי, אנו מאמינים שיש צורך ליישם את מחקרי התערבות במידת האפשר לחקור את היעילות של אסטרטגיות טיפוליות. בנוסף, יש צורך קריטי כדי לבצע הליכים סטנדרטיים עבור ניתוחים הנגע כולל אפיון מתקדמים של הרכב הסלולר הנגע טרשת עורקים בשלב מאוחר על ידי מיפוי גורל ו phenotyping.
הרוב המכריע של טרשת עורקים מחקרים להתמקד מודלים למניעת טרשת עורקים המורכב סמים טיפול או ג’ין מניפולציה (הסתרה או טוק-) בעכברים צעירים בריאים, לפני המחלה החניכה, התקדמות. מחקרים אלה חשפו מספר רב של גנים, מולקולות איתות כי תפקיד בהתפתחות טרשת עורקים. עם זאת, רוב היעדים הללו נכשלה לתרגם טיפולים יעילים-אנוש. אכן, קשה להסיק את האפקט שהתרפיה על עכברים צעירים בריאים לחולים קשישים עם מתקדם התרדמה. ככזה, ביצוע מחקרי התערבות בצבר ניסיוני פרה סביר מספק תיאור מדויק יותר של רלוונטיות ואת היעילות של חדש טיפולית. הרעיון נתמך על ידי ההשפעות השונות של עיכוב של ציטוקינים פרו-דלקתיים אינטרלוקין-1β (IL-1β) בעת העסקת מניעת4,5,6 או התערבות האסטרטגיה7. ההבדלים בין מניעת התערבות מחקרים מראים כי תהליכים תאיים שונים מתרחשים שלבים שונים של התפתחות טרשת עורקים, מדגיש את העובדה כי מחקרים מניעה צפויים מספיקות לדגמן את התרחיש קליני במידה מספקת.
איגוד הלב האמריקני פרסם לאחרונה הצהרה מדעי המפרט המלצות עבור עיצוב ניסיוני נכונה, סטנדרטיזציה פרוצדורלי, ניתוח ודיווח של מחקרים בבעלי חיים טרשת עורקים8. זה מדגיש את יתרונותיה וחסרונותיה של השולט טכניקות בשימוש בתחום. לדוגמה, פנים en סודאן הרביעי מכתים של אבי העורקים מבוצע לעתים קרובות כמו read-out הראשון. למרות פנים en סודאן הרביעי מכתים של השומנים התצהיר היא שיטה מתאימה להערכת מהנטל פלאק גלובלי, הוא לא מסוגל להבחין נגעים פס שומני בשלב מוקדם של נגעים בשלב מאוחר יותר מתקדמים. ככזה, הפרשנות של צביעת פנים en לעתים קרובות מעורפלות ולא שטחית9. ניתוח זהיר של רקמות חתכי רוחב באמצעות גודל הספינה, הנגע ו לומן פרמטרים מורפולוגיות כימות מדדים של הנגע יציבות מספקת הבנה מדויקת יותר של התוצאה של ניסוי.
לבסוף, histopathology האנושי שמחקרים הראו כי הרכב הסלולר הוא מנבא טוב יותר של קרע יותר מגודל הנגע עצמו, עם נגעים המסכן בתאי השריר החלק (SMC) ועשיר מקרופאגים להיות רגישים יותר להיקרע10, 11. תצפיות אלה התבססו על צביעת עבור סמני בסגנון קלאסי המשמש לזיהוי התא (קרי, ACTA2 SMC, LGALS3 או CD68 עבור מקרופאגים). עם זאת, הביטוי של סמנים אלה אינה מוגבלת אך ורק לסוג תא בודד בנגעים טרשת עורקים עקב הפלסטיות של שושלות מרובים כולל SMC, תאי אנדותל, התאים מיאלואידית12. בפרט, זיהוי ברורה וחד משמעית SMC בתוך הנגע טרשת עורקים היה כמעט בלתי אפשרי עד העשור בגלל המאפיין של תאים אלה כדי dedifferentiate וידכא את הגנים שלהם סמן שושלת היוחסין הספציפי (תהליך המכונה בשם מיתוג פנוטיפי) כלי פצוע או חולה13. מגבלה זו בזיהוי SMC יש כבר עקפו על ידי הפיתוח של שושלת היוחסין עקיבה7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. הוא מורכב לצמיתות labelling הצאצאים שלהם וסנו לאתר שלהם הגורל וההתפתחות פנוטיפי במהלך התקדמות טרשת עורקים על ידי שימוש בשילוב של הביטוי של recombinase Cre מונע על ידי היזמים SMC ספציפיים (קרי, Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24,25, Acta226 ו, SM22α14,16) והפעלה של כתבים (למשל, חלבונים פלורסנט, β-galactosidase) [הנסקרת ב Bentzon ו Majesky 201827]. אחד המחקרים הראשונים העסקת SMC עקיבה שושלת היוחסין מחוץ להגדרה מופרה, שפר ואח14 סיפק ראיות כי SMC יכול לווסת שלהם פנוטיפ, transdifferentiate לתוך תאים chondrogenic במהלך הסתיידות כלי הדם באמצעות SM22α Cre R26R LacZ שושלת היוחסין עקיבה מודל. למרות מחקרים אלה חלוץ SMC שושלת היוחסין עקיבה, הם היו חלקית משמעיות כי כל נתון שאינו-SMC SM22α לביטוי בסביבה של המחלה תווית על ידי הכתב. מגבלה זו הספינה נעקף על ידי פיתוח ושימוש של טמוקסיפן-inducible Cre ERT/LoxP המתיר פקד הטמפורלי של תיוג תא תא תיוג מתרחשת באופן בלעדי במהלך הלידה טמוקסיפן, יוגבלו לתא לבטא את התא ייחודיים לסוג יזם נהיגה Cre ERT ביטוי בזמנו של חשיפה טמוקסיפן, הימנעות העקיבה של סוגי תאים חלופי הפעלת Cre ב הגדרה של התקדמות המחלה. לצורך מעקב אחר שושלת היוחסין של SMC ב טרשת עורקים, טמוקסיפן-inducible Myh11– Cre/ERT2 transgene הקשורים עם כתבים פלורסנט (eYFP7,15,17,18 , 21, mTmG19,25, קונפטי20,22,23 ללימודי משובט הרחבה) הוכיחה יעילות יוצאת דופן וספציפיות של SMC תיוג ויש לו היו בשימוש לאוכלוסיות SMC מפת גורל בנגעים טרשת עורקים במחקרים אחרונים. חשוב מכך, מחקרים אלה חשפו: 1) 80% SMC בהישג מתקדמת טרשת עורקים לעשות לא לבטא כל קונבנציונאלי SMC סמנים (ACTA2, MYH11) המשמש בניתוח immunohistological, ולכן צריך כבר טעינו בזיהוי ללא מעקב אחר שושלת היוחסין 17; 2) קבוצות משנה של SMC אקספרס סמנים של סוגי תאים חלופי כולל סמני מקרופאג או תאי הגזע mesenchymal סמני16,17,19; ו 3) SMC להשקיע ואכלוס הנגע טרשת עורקים על ידי התרחבות oligoclonal ולשמר SMC שיבוטים פלסטיות למעבר אוכלוסיות שונות phenotypically20,23. לסיכום, ברור כעת כי תאי שריר חלק להציג מגוון פנוטיפי מדהים טרשת עורקים, יכולה להיות מועילה או מזיקה תפקידים על הנגע פתוגנזה בהתאם לאופי מעברים פנוטיפי שלהם. תגליות אלה מייצגים שדרה מדהים טיפולית חדשה עבור מיקוד SMC קידום athero פנוטיפי מעברים בין טרשת עורקים בשלב מאוחר.
במסמך זה, אנו מציעים פרוטוקול סטנדרטיים לניתוח בשלב מאוחר מאתר התרדמה כולל שיטות שיטתית לנתיחה בעלי חיים, הטבעה, חלוקתה, מכתים של כימות של העורק brachiocephalic נגעים. כדי לקבוע את ההשפעה של אינטרלוקין-1β עיכוב על גורל SMC, פנוטיפ, השתמשנו השושלת SMC עקיבה ספקיות– / – עכברים שקיבלו תזונה מערבית 18 שבועות לפני קבלת זריקות שבועיות של נוגדן anti-IL1β או שליטה IgG מתאימים isotype.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות עשרות שנים של מחקר, ההתקדמות הטכנית בלימוד טרשת עורקים, השדה יש היסטוריה מאכזב של תרגום ממצאים מדעיים כדי טיפולים קליניים34,35. תופעה זו ניתנת להסבר באופן חלקי על ידי סתירות חייתיים, עיצובים מוטוריים, וניתוחים הנגע. במסמך זה, אנו מתארים של צינור ניסיוני ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למרכז וחיסונים הדמיה (נתמך על-ידי-1S10OD019973-01-NIH) ב אוניברסיטת פיטסבורג לסיוע שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי נתמך על ידי מענק פיתוח מדעי 15SDG25860021 של איגוד הלב האמריקני כדי ה2 R.A.B. נתמכה על ידי NIH להעניק F30 HL136188.
Materials
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Tissue perfusion and fixation |
| 23G butterfly needle | Fisher | BD367342 | |
| 25G needle | Fisher | 14-821-13D | |
| A1 Confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| ACTA2-FITC antibody (mouse) | Sigma Aldrich | F3777 | Primary Antibody |
| Alexa-647 anti goat | Invitrogen | A-21447 | Secondary antibody |
| Antigen Unmasking solution, Citric acid based | Vector Labs | H-3300 | Antigen retrieval solution |
| Chow Diet | Harlan Teklad | TD.7012 | |
| Coverslip | Fisher | 12-544-14 | Any 50 x 24 mm cover glass |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Nucleus fluorescent counterstaining |
| Donkey Alexa-488 anti-rabbit | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody |
| Donkey Alexa-555 anti-rat | Abcam | ab150154 | Secondary antibody |
| DPBS 10X without Calcium and Magnesium | Gibco | 14200166 | PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water |
| Embedding cassette | Fisher | 15-182-701D | |
| ETDA vacuum tube | Fisher | 02-685-2B | |
| Ethanol 200 proof | Decon | 2701 | |
| Foam pad | Fisher | 22-222-012 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7765 | |
| GFP antibody (goat) | abcam | ab6673 | Primary antibody |
| goat IgG control | Vector Labs | I-5000 | IgG control |
| High Fat Diet | Harlan Teklad | TD.88137 | |
| ImageJ | NIH | Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LGALS3 antibody (rat) | Cedarlane | CL8942AP | Primary antibody |
| LSM700 confocal microscope | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microscope Slides, Superfrost Plus | Fisher | 12-550-15 | |
| Microtome blades | Fisher | 30-538-35 | |
| Mouse IgG control | Vector Labs | I-2000 | IgG control |
| NIS element imaging software | Nikon | Imaging software for z-stack image acquisition | |
| Normal Horse serum | Sigma Aldrich | H1270 | |
| Pap Pen | Fisher | 50-550-221 | |
| Peanut oil | Sigma | P2144 | |
| Prolong gold Antifade mountant | Invitrogen | P36930 | Mounting medium |
| Rabbit IgG control | Vector Labs | I-1000 | IgG control |
| Rat IgG control | Vector Labs | I-4000 | IgG control |
| RUNX2 antibody (rabbit) | Abcam | ab192256 | Primary Antibody |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml syringe |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Xylene | Fisher | X55K-4 | |
| Zen imaging software | Zeiss | Imaging software for z-stack image acquisition |
Referenzen
- GBD DALYs and HALE Collaborators. Global, regional, and national disability-adjusted life-years (DALYs) for 315 diseases and injuries and healthy life expectancy (HALE), 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet. 388 (10053), 1603-1658 (2016).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137 (12), 67-92 (2018).
- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32 (1), 40-51 (2014).
- Bhaskar, V., et al. Monoclonal antibodies targeting IL-1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in Apolipoprotein E-deficient mice. Atherosclerosis. 216 (2), 313-320 (2011).
- Isoda, K., et al. Lack of interleukin-1 receptor antagonist modulates plaque composition in apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (6), 1068-1073 (2004).
- Kirii, H., et al. Lack of interleukin-1beta decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (4), 656-660 (2003).
- Gomez, D., et al. Interleukin-1β has atheroprotective effects in advanced atherosclerotic lesions of mice. Nature Medicine. 24, 1418-1429 (2018).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 121 (6), 53-79 (2017).
- Baylis, R. A., Gomez, D., Owens, G. K. Shifting the Focus of Preclinical, Murine Atherosclerosis Studies From Prevention to Late-Stage Intervention. Circulation Research. 120 (5), 775-777 (2017).
- Kolodgie, F. D., et al. Pathologic assessment of the vulnerable human coronary plaque. Heart. 90 (12), 1385-1391 (2004).
- Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20 (5), 1262-1275 (2000).
- Gomez, D., Owens, G. K. Smooth muscle cell phenotypic switching in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 95 (2), 156-164 (2012).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).
- Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circulation Research. 104 (6), 733-741 (2009).
- Gomez, D., Shankman, L. S., Nguyen, A. T., Owens, G. K. Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections. Nature Methods. 10 (2), 171-177 (2013).
- Feil, S., et al. Transdifferentiation of vascular smooth muscle cells to macrophage-like cells during atherogenesis. Circulation Research. 115 (7), 662-667 (2014).
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nature Medicine. 21, 628 (2015).
- Cherepanova, O. A., et al. Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective. Nature Medicine. 22, 657 (2016).
- Albarran-Juarez, J., Kaur, H., Grimm, M., Offermanns, S., Wettschureck, N. Lineage tracing of cells involved in atherosclerosis. Atherosclerosis. 251, 445-453 (2016).
- Chappell, J., et al. Extensive Proliferation of a Subset of Differentiated, yet Plastic, Medial Vascular Smooth Muscle Cells Contributes to Neointimal Formation in Mouse Injury and Atherosclerosis Models. Circulation Research. 119 (12), 1313-1323 (2016).
- Newman, A. A., et al. Irradiation abolishes smooth muscle investment into vascular lesions in specific vascular beds. JCI Insight. 3 (15), (2018).
- Dobnikar, L., et al. Disease-relevant transcriptional signatures identified in individual smooth muscle cells from healthy mouse vessels. Nature Communications. 9 (1), 4567 (2018).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 regulates clonality and fate of smooth muscle-derived atherosclerotic plaque cells. Nature Communications. 9 (1), 2073 (2018).
- Majesky, M. W., et al. Differentiated Smooth Muscle Cells Generate a Subpopulation of Resident Vascular Progenitor Cells in the Adventitia Regulated by Klf4. Circulation Research. 120 (2), 296-311 (2017).
- Herring, B. P., Hoggatt, A. M., Burlak, C., Offermanns, S. Previously differentiated medial vascular smooth muscle cells contribute to neointima formation following vascular injury. Vascular Cell. 6, 21 (2014).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Science Translational Medicine. 7 (308), (2015).
- Bentzon, J. F., Majesky, M. W. Lineage tracking of origin and fate of smooth muscle cells in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 114 (4), 492-500 (2018).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nature Medicine. 14 (1), 64-68 (2008).
- Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14 (5), 405-408 (2001).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D’Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2408-2415 (2004).
- Durgin, B. G., et al. Smooth muscle cell-specific deletion of Col15a1 unexpectedly leads to impaired development of advanced atherosclerotic lesions. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 943-958 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Lin, M. E., et al. Runx2 Deletion in Smooth muscle Cells Inhibits Vascular Osteochondrogenesis and Calcification but not Atherosclerotic Lesion Formation. Cardiovascular Research. , (2016).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Nishioka, T., et al. Contribution of inadequate compensatory enlargement to development of human coronary artery stenosis: An in vivo intravascular ultrasound study. Journal of the American College of Cardiology. 27 (7), 1571-1576 (1996).
- Pasterkamp, G., et al. Paradoxical Arterial-Wall Shrinkage May Contribute to Luminal Narrowing of Human Atherosclerotic Femoral Arteries. Circulation. 91 (5), 1444-1449 (1995).
- Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
- Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative analysis and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus. Journal of Visual Experiments. (82), 50933 (2013).
