平滑筋細胞系譜トレース マウスの高度な動脈硬化病変における細胞構成の定量的解析
Summary
動物解剖、組織を埋め込む、断面、染色、腕頭動脈の分析の体系的な方法を含む後期マウスの動脈硬化病変の細胞構成を特徴づけるための標準化されたプロトコルを提案します。atheroprone 平滑筋細胞系譜トレース マウス。
Abstract
動脈硬化は世界における死亡の主要な原因と、有望な治療上のターゲットを記述する無数の前臨床研究にもかかわらず新規介入はとらえどころのない残っています。これは可能性が高いため、一部では、確立された病気ではなく、遺伝子操作や動脈硬化の進展に対する薬理学的治療法の効果を調べる臨床予防モデルに依存します。また、これらの研究の結果は、表在病変解析の使用と病変の細胞集団の特性の不足のため交絡しばしば。これらの並進のハードルを克服するためには、蛍光抗体染色および共焦点顕微鏡による単一細胞レベルでの細胞組成の変化の調査を用いる介入モデル依存の増加を提案します。このため、動物解剖、埋め込み、および断面、染色、腕頭動脈病変の定量化のための体系的なアプローチを含むマウス介入モデルで推定される治療上のエージェントをテストするためのプロトコルについて述べる。さらに、末期動脈硬化病変内のセルの表現型多様性によるセル固有の誘導の系譜トレース マウス システムとどのようにこれは公平な評価に利用できますを使用しての重要性を述べるアテローム性動脈硬化病変の細胞集団。一緒に、これらの戦略はより正確に治療上の介在をモデル化および動脈硬化性疾患を分析する血管生物学者を助けるかもしれない、臨床試験の成功のより高い速度に変換されますうまくいけば。
Introduction
動脈硬化は、罹患率と死亡率の世界的冠動脈疾患、末梢動脈疾患、脳卒中の大半の基になる主要な原因です。後期冠動脈アテローム性動脈硬化は、心筋梗塞会計世界人口の死亡率1,2のほぼ 16% を含む重篤な合併症につながります。衝撃その壊滅的な公衆衛生上、新規治療戦略の開発を行うとともに、動脈硬化の進行を駆動メカニズムを解読する実質的な努力をしました。まだ、心血管疾患の臨床試験の承認の可能性 (LOA) 率は最低水準 (8.7% 相) のみ他の臨床フィールドと比較すると3です。これは説明することができます一部で多くの障壁によってその動脈硬化のポーズをほぼユビキタス性質、臨床的に無声進行の重要な病気の不均一性など効率的な医薬品開発へ。さらに、前臨床動物実験の準最適設計に臨床的翻訳の成功の欠如説明もできます。具体的には、治療戦略の有効性を調査するため可能な限り介入研究を実施する必要があると考えています。また、運命のマッピングおよび表現型解析によって末期動脈硬化病変の細胞構成の高度な特徴を含む病変解析の標準化された手順を実行するための重要な必要性があります。
アテローム性動脈硬化研究の大半は薬物治療や遺伝子操作 (ノックアウトまたはノックアウトの) 病気の開始そして進行の前に、健康な若いマウスの動脈硬化予防のモデルに焦点を当てます。これらの研究は、多数の遺伝子と動脈硬化の進展に関与するシグナル分子を発見されています。ただし、これらのターゲットのほとんどは人間の効率的な治療に翻訳できませんでした。確かに、治療法が高度な動脈硬化病変を有する高齢者患者に健康な若いマウスに及ぼす影響を推定することは困難です。など、可能性が臨床実験的パイプラインにおける介入研究の実装では、関連性と有効性の新しい治療のより正確な描写を提供します。アイデアは、プロ炎症性サイトカイン インターロイキン 1 β (il-1) を阻害する予防4,5,6または介入戦略7を採用の著しく発散効果によってサポートされます。予防と介入研究の違いは、異なる細胞プロセスが動脈硬化の進展のさまざまなフェーズで発生し、予防の研究の可能性があるという事実を強調を示唆している臨床のシナリオをモデル化するが不足しています。適切に。
アメリカ心臓協会は最近、適切な実験計画、手順の標準化、分析、および動物の動脈硬化研究8のレポートの推奨事項を詳述した科学的な声明を発表しました。これは、利点と制限フィールドで使用される支配的な技術をハイライトします。たとえば、最初の読み出しとしてアン顔スーダン IV は、大動脈の染色はしばしば実行されます。脂質沈着のアン顔スーダン IV 染色はグローバル プラーク負担の評価に適した方法より高度な遅段階の病変を早期脂肪筋病変を区別することはないです。など、アンの顔を汚すの解釈はしばしばあいまいな、うわべだけの9です。慎重に分析組織の形態学的パラメーター容器、病変、および内腔のサイズと病変の安定性の指標の定量化を使用して断面積実験の効果のより正確な理解を提供します。
最後に、人間の病理組織学的研究は、細胞構成が平滑筋細胞 (SMC) 病変の貧乏人および10、破裂しやすくされているマクロファージが豊富と病巣の大きさ自体よりも破断のよりよい予測因子であることを示唆しています。 11。これらの観察は、古典的な細胞の識別に使用されるマーカーの染色に基づいていた (すなわち、SMC と LGALS3 または大食細胞の CD68 の ACTA2)。ただし、これらのマーカーの発現は SMC、血管内皮細胞、骨髄細胞の12を含む複数の系統の可塑性による動脈硬化病変における 1 つのセル型に厳密に制限されません。特に、動脈硬化病変内で SMC の明白な識別は事実上不可能過去 10 年まで「脱分化」と (プロセスと呼ばれる系統特異的マーカー遺伝子を抑制するこれら細胞特性のため表現型スイッチング) 負傷したまたは患部の血管13。SMC の識別にこの制限はリネージュ トレース7,14,15,16,17,18,の開発によって回避されています19,20,21,22,23,24. それ永久にラベリング Cre リコンビナーゼ SMC 特異的発現プロモーターによる発現の組み合わせを使用してアテローム性動脈硬化の進行中に彼らの運命と表現型進化を追跡するには、SMC と彼らの子孫成っている (すなわち、 Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23,24、26 Acta225、と、 SM22α14,16) と記者 (例えば、蛍光タンパク質、β-ガラクトシダーゼ) [Bentzon と Majesky で確認の活性化201827]。胚外 SMC リネージュ トレースを用いた最初の研究の 1 つは、シュペーアら14は、SMC 調節することが彼らの表現型と分化形質転換軟骨細胞に血管石灰化の間を使用して証拠を提供SM22α Cre R26R LacZ 系統のトレース モデル。これらの研究は、トレースする SMC 血統を開拓した、病気の設定で任意の与えられた非 SMC 表現する SM22α はレポーターによって分類されること、部分的に明白でした。この制限は開発と使用のタモキシフェン誘導 Cre ERT/LoxP 細胞ラベリングの時空間制御を許可によってバイパスされています。タモキシフェンの配信中にのみ発生する細胞ラベリングと代替セル型で Cre のアクティブ化の追跡を回避する運転 Cre ERT 式タモキシフェン露出の時にセル型固有プロモーターを表現するセルに限定されます、病気の進行の設定。動脈硬化、蛍光レポーター (eYFP7,15,17,18に関連付けられているタモキシフェン誘導Myh11– Cre/ERT2 transgene の SMC のトレースする血統の,21, mTmG19,25, 紙吹雪20,22,23クローン性増殖研究) 顕著な効率と SMC のラベリングの特異性を示しているし、は最近の研究で動脈硬化病変における運命地図 SMC 個体群に使用されています。重要なは、これらの研究は、それを明らかにした: 1) SMC の 80% 内高度動脈硬化病変は発現していない、従来 SMC マーカー (ACTA2、MYH11) 免疫組織学的解析のため、したがって系譜トレースせず誤認されているだろう17;2) SMC のサブセット エクスプレス マクロファージ マーカーまたは間葉系幹細胞マーカー16,17,19を含む代替セル型のマーカー・ 3) SMC 投資し、オリゴグローナル拡張、動脈硬化病変と SMC クローン保持可塑性表現型別の集団20,23に移行します。要約すれば、それは今オフに平滑筋細胞が動脈硬化病変における顕著な表現型の多様性を提示し、その表現型変化の性質に応じて病変発生機序に関する有益なまたは有害な役割を持つことができます。これらの発見は、SMC 末期動脈硬化の粥腫推進表現型転移をターゲットに顕著な新しい治療上の道を表しています。
ここで、動物解剖、埋め込み、断面、染色、腕頭動脈病変の定量化のための体系的なメソッドを含む後期マウスの動脈硬化病変を分析するための標準化されたプロトコルを提案する.SMC 運命と表現型に及ぼすインターロイキン 1 β 阻害を決定するには、SMC リネージュ アポ-/-マウス抗 IL1β 抗体の IgG アイソタイプ対照毎週注射を受ける前に 18 週間西部飼料をトレースを使用しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
研究とアテローム性動脈硬化を勉強の技術進歩の数十年にもかかわらずフィールド臨床治療34,35の科学的知見を翻訳の残念な歴史があります。この現象は、動物モデル、実験デザイン、および病変の解析での不具合によって部分的に説明されるかもしれない。ここで、リネージュ トレース マウス7を使用して高度な動脈硬化病変に…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
彼らの支援のためピッツバーグの大学で生物学的イメージング (NIH 1S10OD019973-01 でサポート)、中心に感謝しますこの作品が支持された総局 R.A.B. に米国心臓協会からの 15SDG25860021 によって支えられた科学的な開発補助金によってサポートは NIH F30 HL136188 を付与します。
Materials
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Tissue perfusion and fixation |
| 23G butterfly needle | Fisher | BD367342 | |
| 25G needle | Fisher | 14-821-13D | |
| A1 Confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| ACTA2-FITC antibody (mouse) | Sigma Aldrich | F3777 | Primary Antibody |
| Alexa-647 anti goat | Invitrogen | A-21447 | Secondary antibody |
| Antigen Unmasking solution, Citric acid based | Vector Labs | H-3300 | Antigen retrieval solution |
| Chow Diet | Harlan Teklad | TD.7012 | |
| Coverslip | Fisher | 12-544-14 | Any 50 x 24 mm cover glass |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Nucleus fluorescent counterstaining |
| Donkey Alexa-488 anti-rabbit | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody |
| Donkey Alexa-555 anti-rat | Abcam | ab150154 | Secondary antibody |
| DPBS 10X without Calcium and Magnesium | Gibco | 14200166 | PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water |
| Embedding cassette | Fisher | 15-182-701D | |
| ETDA vacuum tube | Fisher | 02-685-2B | |
| Ethanol 200 proof | Decon | 2701 | |
| Foam pad | Fisher | 22-222-012 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7765 | |
| GFP antibody (goat) | abcam | ab6673 | Primary antibody |
| goat IgG control | Vector Labs | I-5000 | IgG control |
| High Fat Diet | Harlan Teklad | TD.88137 | |
| ImageJ | NIH | Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LGALS3 antibody (rat) | Cedarlane | CL8942AP | Primary antibody |
| LSM700 confocal microscope | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microscope Slides, Superfrost Plus | Fisher | 12-550-15 | |
| Microtome blades | Fisher | 30-538-35 | |
| Mouse IgG control | Vector Labs | I-2000 | IgG control |
| NIS element imaging software | Nikon | Imaging software for z-stack image acquisition | |
| Normal Horse serum | Sigma Aldrich | H1270 | |
| Pap Pen | Fisher | 50-550-221 | |
| Peanut oil | Sigma | P2144 | |
| Prolong gold Antifade mountant | Invitrogen | P36930 | Mounting medium |
| Rabbit IgG control | Vector Labs | I-1000 | IgG control |
| Rat IgG control | Vector Labs | I-4000 | IgG control |
| RUNX2 antibody (rabbit) | Abcam | ab192256 | Primary Antibody |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml syringe |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Xylene | Fisher | X55K-4 | |
| Zen imaging software | Zeiss | Imaging software for z-stack image acquisition |
Referenzen
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