부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스의 고급 동맥 경 화성 병 변에서 세포 성분의 정량 분석
Summary
우리 세포 단계의 murine 동맥 경 화성 병 변 포함 하 여 동물 해 부, 조직 포함, 단면, 얼룩, 및 brachiocephalic 동맥의 분석의 체계적인 방법을 구성 하는 표준화 된 프로토콜을 제안 atheroprone에서 부드러운 근육 세포 계보 추적 마우스.
Abstract
동맥 경화 남아 죽음은 전세계의 주요 원인이 고, 유망한 치료 목표를 설명 수많은 임상 연구에도 불구 하 고 소설 개입 하기 어려운 남아 있다. 이것은 가능성이 인해, 부분적으로, 설립된 질병 보다는 오히려 유전 조작 또는 아 테 롬 개발에 약물 치료의 효과 조사 하는 임상 예방 모델에 대 한 신뢰. 또한, 이러한 연구의 결과 종종 혼동 표면 병 변 분석의 사용 및 병 변 세포 인구 특성의 부족 때문에. 이러한 변환 장애물을 극복 하기 위해, 우리는 immunofluorescent 얼룩이 지 고 confocal 현미경 검사 법에 의해 단일 세포 수준에서 세포 구성에서 변경의 조사를 고용 하는 개입 모델에 증가 신뢰를 제안 합니다. 이 위해, 우리는 murine 개입 모델 동물 해 부, 포함, 단면, 얼룩, 및 brachiocephalic 동맥 병 변의 정량화에 대 한 체계적인 접근을 포함 하 여 상 상속 치료 에이전트를 테스트 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다. 더하여, 단계의 동맥 경 화성 병 변 내의 세포의 phenotypic 다양성으로 인해 셀 전용, 유도할 수 있는 혈통 추적 마우스 시스템 및 어떻게이 편견된 특성에 대 한 활용할 수 있는 사용의 중요성 설명 동맥 경 화성 병 변 세포의 인구 함께, 이러한 전략 혈관 생물학 더 정확 하 게 치료 개입 모델 동맥 경 화성 질환 분석을 지원할 수 있다 하 고 잘하면 임상 시험에 성공의 높은 속도으로 번역할 것 이다.
Introduction
동맥 경화 병 적 상태와 사망률 전세계 기본 관상 동맥 질환, 말 초 동맥 질환 및 뇌졸중의 대부분의 주요 원인입니다. 단계의 관상 동맥 경화는 심근 위반 회계 세계 인구 사망률1,2의 거의 16%를 포함 하 여 심각한 합병증으로 이어질 수 있습니다. 때문에 공중 보건에 미치는 파괴적인 영향, 상당한 노력이 했다 비 발한 치료 전략 개발로 동맥 경화 진행을 운전 메커니즘을 해독. 그러나, 심장 혈관 질환에 대 한 임상 시험의 승인 가능성 (LOA) 속도 (단 대 8.7% 단계) 다른 임상 분야와 비교할 때 낮은 중3입니다. 이 설명 될 수 있는 부분에 많은 방 벽에 의해 그 롬 포즈 효율적인 신약 개발 거의 유비 쿼터 스 자연, 침묵-임상 진행 및 중요 한 질병이 포함. 또한, 전 임상 동물 연구의 차선 디자인 또한 임상 번역에 성공의 부족에 대 한 차지 수 있습니다. 특히, 우리는 개입 연구 가능한 치료 전략의 효능을 조사 하기 위해 구현 해야 하는 것을 믿는다. 또한, 병 변 분석 단계의 동맥 경 화성 병 변 세포 구성의 고급 특성을 포함 하 여 운명 매핑 및 형질에 대 한 표준화 된 절차를 수행 하는 중요 한 필요가 있다.
아 테 롬 연구의 대부분은 동맥 경화 예방 약물 치료 나 유전자 조작 (녹아웃 또는 노크-) 질병 개시 및 진행 하기 전에 건강 한 젊은 쥐에서 구성 된 모델에 초점. 이러한 연구는 유전자 및 아 테 롬 개발에 역할을 하는 신호 분자의 많은 수를 발견 했다. 그러나, 이러한 목표의 대부분 인간의 효율적인 치료를 번역 하지 못했습니다. 사실, 고급 동맥 경 화성 병 변 노인 환자에 게 건강 한 젊은 쥐에는 치료 효과 추정 하는 것이 어렵습니다. 등, 구현 가능성이 전 임상 실험 진행중 개입 연구의 관련성 및 새로운 효능 치료의 더 정확한 묘사를 제공 한다. 아이디어는 프로-염증 성 사이토카인 인터 루 킨-1β (IL 1β)을 억제 하는 예방4,,56 또는 개입 전략7을 사용 하는 경우의 현저 하 게 분기 효과 의해 지원 됩니다. 예방 및 개입 연구의 차이점 제안 다른 세포질 과정 동맥 경화 증 개발의 여러 단계에서 발생 하 고 예방 연구 가능성이 있다는 사실을 강조 임상 시나리오를 모델링 하는 데 부족 한 적절 하 게.
미국 심장 협회는 최근 과학 문을 자세히 적절 한 실험 설계, 절차 표준화, 분석, 및 동물 아 테 롬 연구8의 보고에 대 한 권장 사항을 출판. 그것은 혜택 및 필드에 사용 되는 주된 기술의 한계를 강조 표시 합니다. 예를 들어 en 얼굴 수단 IV는 대동맥의 얼룩 종종 첫 번째 읽기로 수행 됩니다. En 얼굴 수단 IV의 지질 증 착 얼룩 글로벌 패 부담에 대 한 평가 적당 한 방법 이지만, 고급 단계의 병 변 초기 단계 지방 조 흔 병 변을 구별할 수 아니다. 이와 같이, en 얼굴 얼룩의 해석 종종 모호 하 고 피상적인9입니다. 조심 분석 조직의 횡단면 형태 론 적 매개 변수 그릇, 병 변, 고 루멘 크기와 병 변 안정성의 지표의 정량화를 사용 하 여 실험의 효과의 더 정확한 이해를 제공 합니다.
마지막으로, 인간의 histopathology 연구 세포 구성 부드러운 근육 세포 (SMC)에 병 변 가난한와 풍부한 세포10, 파열을 더 따르게 되 고, 병 변 크기 보다 파열의 더 나은 예언자는 제안 했다 11. 이러한 관측 마커 고전적인 셀 식별에 사용에 대 한 얼룩에 근거 했다 (즉, SMC 및 LGALS3 또는 세포에 대 한 CD68 ACTA2). 그러나, 이러한 마커 표현의 여러 계보 SMC, 골수성 세포12, 내 피 세포 등의 동맥 경 화성 병 변에서가 소성 때문에 단일 셀 형식에 엄격 하 게 제한 되지 않습니다. 특히, 동맥 경 화성 병 변 내 SMC의 명확한 식별 사실상 불가능 했다 지난 10 년간까지 dedifferentiate 및 그들의 계보 특정 마커 유전자 (프로세스 라고 참다 이러한 셀의 속성 때문에 phenotypic 스위칭) 부상 또는 질병 혈관13에. SMC 식별에서이 제한 혈통 추적7,14,15,,1617,18, 의 개발에 의해 피할 되었습니다. 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. 영구적으로 Cre recombinase SMC 특정 발기인에 의해 구동의 식의 조합을 사용 하 여 동맥 경화의 진행 하는 동안 그들의 운명 및 phenotypic 발전을 추적 하는 SMC와 그들의 자손을 라벨로 구성 됩니다 (즉, Myh117,15,17,18,19,20,21,,2223 , 24, Acta225,26 , SM22α14,16)와 기자 (형광 단백질, β-galactosidase) [검토 Bentzon와 Majesky의 활성화 201827]입니다. 첫 번째 연구 채용 embryogenesis 설정 외부 SMC 혈통 추적 중 하나에서 Speer 외.14 는 SMC 수 변조 그들의 표현 형 및 transdifferentiate chondrogenic 세포로 혈관 석 회화 하는 동안 사용 하 여 증거를 제공 SM22α Cre R26R LacZ 혈통 추적 모델. 그 질병의 설정에서 어떤 주어진된 비 SMC 표현 SM22α 기자에 의해 표시 된 것이 이러한 연구 개척 SMC 혈통 추적, 비록 그들은 부분적으로 애매 했다. 이 제한 사항은 개발 및 사용의 tamoxifen을 유도할 수 있는 Cre ERT/LoxP 셀 라벨의 일시적인 제어 허용에 의해 무시 되었습니다. 셀 라벨 tamoxifen 전달 중 독점적으로 발생 하 고 다른 종류의 세포에 Cre 활성화 추적을 피하고 셀 형식 관련 발기인 Cre ERT 식 tamoxifen 노출 시간에 운전을 표현 하는 셀을 제한 될 것 이다는 질병의 진행의 설정입니다. 동맥 경화, tamoxifen을 유도할 수 있는 Myh11-Cre/ERT2 transgene 형광 기자 (eYFP7,15,,1718 연관에 SMC의 혈통 추적에 대 한 , 21, mTmG19,25, 클론 확장 연구 색종이20,,2223 ) 놀라운 효율성과 SMC 라벨에 특이성을 입증 했다 고 최근 연구에서 동맥 경 화성 병 변에서 운명 지도 SMC 인구에 사용 되었습니다. 중요 한 것은, 이러한 연구는 계시 했다: 1) SMC의 80% 이내 고급 동맥 경 화성 병 변 할 표현 하지 어떤 기존의 SMC 마커 (ACTA2, MYH11) immunohistological 분석에 사용 하 고 따라서 것가지고 되었습니다 오인 혈통 추적 없이 17; 다른 종류의 세포 대 식 세포 마커 또는 중간 엽 줄기 세포 마커16,,1719;를 포함 하 여 마커를 표현 하는 2) SMC의 하위 집합 그리고 3) SMC 투자 oligoclonal 확장 동맥 경 화성 병 변 채울 및 SMC 클론 phenotypically 다른 인구20,23전환가 소성 유지. 요약, 그것은 이제 분명 부드러운 근육 세포 동맥 경 화성 병 변에서 놀라운 phenotypic 다양성을 제시 하 고 그들의 phenotypic 전환의 성격에 따라 병 변 병에 유익한 또는 해로운 역할을 가질 수 있습니다. 이러한 발견 단계의 동맥 경화에 athero 홍보 phenotypic 전환 SMC 대상에 대 한 놀라운 새로운 치료 애비뉴를 나타냅니다.
여기, 우리는 분석 단계의 murine 동맥 경 화성 병 변을 포함 하 여 동물 해 부, 포함, 단면, 얼룩, 및 brachiocephalic 동맥 병 변의 정량화에 대 한 체계적인 방법에 대 한 표준화 된 프로토콜을 제안 합니다. SMC 운명과 표현 형에 인터 루 킨-1β 억제의 효과 확인 하려면 우리는 SMC 혈통 ApoE-/- 생쥐는 안티-IL1β 항 체의 IgG 제어 isotype 일치 주간 주사를 받기 전에 18 주 동안 서쪽 규정식 먹이 추적을 사용 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
수십 년간의 연구 및 동맥 경화를 공부 하 고 기술 발전에 불구 하 고 필드 임상 치료34,35과학적인 발견을 번역의 실망 스러운 역사를가지고 있습니다. 이 현상 동물 모델, 실험적인 디자인, 그리고 병 변 분석에 불일치에 의해 부분적으로 설명 될 수 있습니다. 여기는 우리 혈통 추적 마우스7를 사용 하 여 고급 동맥 경 화성 병 변에서 ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그들의 도움에 대 한 피츠버그 대학에서 생물 학적 이미징 (NIH 1S10OD019973-01에 의해 지원)에 대 한 중심을 감사 합니다. 이 작품은 지원 여 D.G. R.A.B.에는 미국 심장 협회에서 15SDG25860021에 의해 지원 되었다 과학 개발 교부 금에 의해 지원 됩니다 NIH 부여 F30 HL136188.
Materials
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Tissue perfusion and fixation |
| 23G butterfly needle | Fisher | BD367342 | |
| 25G needle | Fisher | 14-821-13D | |
| A1 Confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| ACTA2-FITC antibody (mouse) | Sigma Aldrich | F3777 | Primary Antibody |
| Alexa-647 anti goat | Invitrogen | A-21447 | Secondary antibody |
| Antigen Unmasking solution, Citric acid based | Vector Labs | H-3300 | Antigen retrieval solution |
| Chow Diet | Harlan Teklad | TD.7012 | |
| Coverslip | Fisher | 12-544-14 | Any 50 x 24 mm cover glass |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Nucleus fluorescent counterstaining |
| Donkey Alexa-488 anti-rabbit | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody |
| Donkey Alexa-555 anti-rat | Abcam | ab150154 | Secondary antibody |
| DPBS 10X without Calcium and Magnesium | Gibco | 14200166 | PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water |
| Embedding cassette | Fisher | 15-182-701D | |
| ETDA vacuum tube | Fisher | 02-685-2B | |
| Ethanol 200 proof | Decon | 2701 | |
| Foam pad | Fisher | 22-222-012 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7765 | |
| GFP antibody (goat) | abcam | ab6673 | Primary antibody |
| goat IgG control | Vector Labs | I-5000 | IgG control |
| High Fat Diet | Harlan Teklad | TD.88137 | |
| ImageJ | NIH | Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LGALS3 antibody (rat) | Cedarlane | CL8942AP | Primary antibody |
| LSM700 confocal microscope | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microscope Slides, Superfrost Plus | Fisher | 12-550-15 | |
| Microtome blades | Fisher | 30-538-35 | |
| Mouse IgG control | Vector Labs | I-2000 | IgG control |
| NIS element imaging software | Nikon | Imaging software for z-stack image acquisition | |
| Normal Horse serum | Sigma Aldrich | H1270 | |
| Pap Pen | Fisher | 50-550-221 | |
| Peanut oil | Sigma | P2144 | |
| Prolong gold Antifade mountant | Invitrogen | P36930 | Mounting medium |
| Rabbit IgG control | Vector Labs | I-1000 | IgG control |
| Rat IgG control | Vector Labs | I-4000 | IgG control |
| RUNX2 antibody (rabbit) | Abcam | ab192256 | Primary Antibody |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml syringe |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Xylene | Fisher | X55K-4 | |
| Zen imaging software | Zeiss | Imaging software for z-stack image acquisition |
Referenzen
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