Isoler la maligne et cellules B Non-Malignant de lck:eGFP poisson-zèbre
Summary
Poisson zèbre transgéniques lck:eGFP express GFP fortement dans les lymphocytes T et ont été utilisés pour étudier le développement des lymphocytes T et la leucémie aiguë lymphoblastique. Cette ligne permet aux cellules d’étude B, qui expriment lck aux niveaux inférieurs. Ce protocole décrit la purification de cellules de B malignes et bénignes du poisson-zèbre de lck:eGFP .
Abstract
Poisson zèbre (Danio rerio) sont un puissant modèle pour étudier le développement des lymphocytes. Comme les mammifères, d. rerio possèdent un système immunitaire adaptatif qui inclut des lymphocytes B et T. Études de poisson-zèbre lymphopoïèse sont difficiles parce que les anticorps reconnaissant d. rerio marqueurs de surface cellulaire ne sont généralement pas disponibles, ce qui complique l’isolement et la caractérisation de populations de lymphocytes différents, y compris la lignée B cellules. Des lignées transgéniques avec expression fluorophore lignée spécifiques sont souvent utilisées pour contourner ce problème. La ligne transgéniques lck:eGFP a été utilisée pour étudier le développement des lymphocytes T d. rerio et a également été utilisée pour le développement des lymphocytes T modèle et de la leucémie lymphoblastique aiguë (lla-T). Bien que les poissons de lck:eGFP ont été largement utilisées pour analyser la lignée T, ils n’ont pas servi à étudier des cellules B. Récemment, nous avons découvert que beaucoup de poisson-zèbre B cellules exprime également lck, quoiqu’à des niveaux inférieurs. En conséquence, les cellules de lck:eGFP B expriment même faibles niveaux de GFP. Fondé sur cette conclusion, nous avons développé un protocole pour purifier les cellules de la lignée B de lck:eGFP poisson-zèbre, dont nous présentons ici. Notre méthode explique comment utiliser un trieur de cellules fluorescentes-activé (FACS) pour purifier les cellules de B de lck:eGFP poisson ou les lignes associées, telles que double-transgéniques rag2:hMYC; LCK:eGFP poissons. Dans ces lignes, cellules B, cellules de B particulièrement immatures, GFP expresse aux niveaux bas mais détectable, leur permettant d’être distingué de lymphocytes T, qui expriment la GFP hautement. B cellules peuvent être isolées de la moelle osseuse, thymus, rate, sang ou d’autres tissus. Ce protocole prévoit une nouvelle méthode pour purifier les cellules B d. rerio , permettant des études axées sur des sujets comme le développement des lymphocytes B et lymphocytes B malignes.
Introduction
Poisson zèbre offrent des attributs puissants, tels que la manipulation génétique, forte fécondité, translucidité optique et un développement rapide qui facilitent l’étude du développement des vertébrés en utilisant des approches génétiques. Ces avantages, ainsi que les caractéristiques partagées de l’hématopoïèse téléostéens et chez les mammifères, font d. rerio idéal pour l’analyse in vivo de la lymphopoïèse et lymphocyte function, depuis leur première apparition chez les larves tout au long de l’âge adulte. Développement de sang chez le poisson zèbre s’appuie sur des processus génétiques bien conservées qui sont partagés avec les mammifères, et ceux-ci portent le système immunitaire adaptatif. En outre, les mécanismes moléculaires qui régissent le développement lymphoïde sont remarquablement conservées entre les mammifères et poissons zèbres1.
Depuis 2 décennies, transgénique d. rerio lignes cette étiquette spécifique sang lignages et lignées mutantes déficientes dans ces lignées ont été créées par2,3,4,5. L’une d’entre elles, la lignée transgénique lck:eGFP , utilise le promoteur zebrafish lymphocytaire protéine tyrosine kinase (lck) pour piloter la GFP expression6. Ce gène, qui est fortement exprimé par les précurseurs de la lignée T et les lymphocytes T matures, permet in vivo par FACS7de suivi du développement des lymphocytes de T thymiques et ex vivo purification de cellules de la lignée T. Auparavant, nous avons utilisé cette ligne dans un écran de mutagenèse ENU avance-génétique pour identifier des mutants de lignée germinale sujettes à T-ALL et d’étudier les phénomènes génétiques somatiquement acquis liés à lymphocytes T oncogenèse8,9.
Récemment, notre laboratoire a prorogé l’utilité du poisson-zèbre de lck:eGFP . Double-transgéniques rag2:hMYC (MYC humain), lck:eGFP D. rerio qui sont connus pour développer lla- 10, nous avons découvert que lignée B se produisent également11. Contrairement au T-ALL dans ce modèle, qui réagissent en couleurs vives en raison de la forte expression de la GFP, B-ALL sont faiblement fluorescentes en raison de faibles niveaux GFP, permettant aux poissons avec B-ALL à distinguer nettement de celles avec T-ALL par microscopie à fluorescence. Cette expression différentielle de la GFP permet aussi la séparation des celluleslo B-ALL GFP de GFPSalut FACS11des cellules T-ALL. En outre, faible lck expression n’est pas unique à poisson zèbre B-ALL, comme humains B-tout aussi express faibles niveaux de LCK11,12. De même, les cellules normales de lignée B de d. rerio, les souris et les humains expriment aussi des faibles niveaux de lck/Lck/LCK, avec des cellules B immatures ayant la plus haute expression11,13. Sur une base par cellule, cellules de la lignée B en lignes de poisson-zèbre ou un dérivé lckeGFP expriment 1-10 % autant GFP comme les lymphocytes T. Ces GFPlo cellules express caractéristique ARNm de lymphocytes B tels que pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighzet autres et peut être purifié de la moelle osseuse, thymus, la rate ou périphérique 11de sang. Donc, les deux B-T-lignée et cellules peuvent être isolées du poisson-zèbre de lckeGFP et dans le cas de rag2hMYC, les lckeGFP animaux, les cellules B et T-ALL ainsi11.
Ici, nous présentons notre protocole efficacement FACS-purifier non malignes cellules B de lck:eGFP poisson-zèbre et bénignes ou malignes des cellules de B de rag2hMYC; LCK:eGFP poissons, à l’aide de divers tissus de source. Ces cellules peuvent même être quantifiées par cytométrie en flux sans isolement de FACS, si vous le souhaitez. Découverte d’expression faible lck – et par conséquent, faible expression de la GFP-par B cellules ouvre de nouvelles portes de possibilités expérimentales de lckeGFP poisson-zèbre, tels que les études sur le développement de cellules in vivo B. Ainsi, cette lignée transgénique, pour la première fois en 2004, a nouvelle vie alors que nous cherchons à utiliser pour glaner des nouvelles perspectives relatives à l’immunité adaptative de poisson-zèbre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons mis au point et fournir un protocole visant à isoler les cellules de B de lck:eGFP zebrafish transgénique, ajoutant cela à d’autres modèles de d. rerio lignée B étiquettes3,4. Étonnamment, l’identification des GFPlo B cellules dans cette rangée est passé inaperçue depuis sa description en 2004. Généralement, lck est considéré comme spécifique à la cellule T6, mais des ét…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Megan Malone-Perez pour les soins de poisson-zèbre et le noyau de cytométrie de flux OUHSC. Ce travail a été soutenu par des subventions de Hyundai Hope sur roues, le centre de l’Oklahoma pour l’avancement des sciences et de technologie (HRP-067), une sentence de projet pilote de NIH/NIGM INBRE (P20, GM103447). JKF détient le E.L. & Thelma Gaylord Endowed Chair en hémato-oncologie pédiatrique de la fondation de l’hôpital des enfants.
Materials
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 ml Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 ml conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin -Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1X | Life Technologies | 11835-030 |
Referenzen
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