Изоляция злокачественные и Non-злокачественные клетки B от lck:eGFP данио рерио
Summary
Данио рерио трансгенных lck:eGFP Экспресс GFP высоко в Т-лимфоцитов и были использованы для изучения развития Т-клеток и острый лимфобластный лейкоз. Эта строка может использоваться для исследования B клеток, которые выражают lck на более низких уровнях. Этот протокол описывает очищение злокачественных и доброкачественных клеток B от lck:eGFP рыбок данио.
Abstract
Данио рерио (Danio рерио) являются мощным модель для изучения развития лимфоцитов. Как и млекопитающие D. рерио обладают адаптивной иммунной системы, которая включает B и T лимфоциты. Исследования у рыбок данио лимфопоэза трудны, потому что антитела, признавая D. рерио клеток поверхностных маркеров, как правило, не доступны, осложняющих изоляции и характеристика лимфоцитов различных групп населения, включая B-линии клетки. Трансгенные линии с Флюорофор линии конкретного выражения часто используются для обхода этой проблемы. Линия трансгенных lck:eGFP был использован для изучения развития D. рерио Т-клеток и также использовались для разработки модели Т-клеток и острый лимфобластный лейкоз (T-ALL). Хотя рыбы lck:eGFP широко использовались для анализа T-линии, они не использовались для изучения B клеток. Недавно мы обнаружили, что многие данио рерио B клетки также выразить lck, хотя и на более низких уровнях. Следовательно клетки lck:eGFP B также выразить низкий уровень GFP. Основываясь на этот вывод, мы разработали протокол, чтобы очистить клетки B-линии от lck:eGFP данио рерио, который мы приводим здесь. Наш метод описывает, как использовать люминесцентные активации клеток сортировщик (FACS) очищает клетки от lck:eGFP рыбы или связанные линии, такие как двойной трансгенных rag2:hMYC; LCK:eGFP рыбы. В этих строках, B клеток, особенно незрелые клетки B, Экспресс GFP на низкой, но обнаружить уровнях, позволяя им следует отличать от Т-клеток, которые выражают GFP высоко. B клетки могут быть изолированы от костного мозга, тимуса, селезенки, крови или других тканей. Этот протокол обеспечивает новый метод для очистки д рерио B клетки, включение исследований было сосредоточено на такие темы, как развитие B-клеток и лимфоцитов злокачественных опухолей.
Introduction
Данио рерио предлагают мощные атрибутов, таких как генетические manipulability, высокая плодовитость, Оптическая прозрачность и быстрое развитие которые облегчают изучение развития позвоночных, использованием генетических подходов. Эти преимущества, вместе с общей характеристики костистых и млекопитающих кроветворения, делают D. рерио идеально подходит для в-vivo анализ функции лимфопоэза и лимфоцитов, от их раннее появление в личинки всей взрослой жизни. Развития крови в zebrafish опирается на хорошо сохранившихся генетических процессов, которые являются общими с млекопитающих, и они распространяются на адаптивной иммунной системы. Кроме того молекулярные механизмы, регулирующие развитие лимфоидных удивительно консервируют между1данио рерио и млекопитающих.
За последние 2 десятилетия трансгенных D. рерио линии что ярлык конкретные крови линий и мутантных линий дефицит этих линий были созданы2,3,4,5. Один из них, трансгенные линии lck:eGFP , использует данио рерио лимфоцитов белки тирозин киназы (lck) промоутер водить GFP выражение6. Этот ген, который сильно выраженные T-линии прекурсоров и зрелых Т-лимфоцитов, позволяет в естественных условиях, отслеживание развития тимуса Т-клеток и ex vivo очистки T-линии клеток, СУИМ7. Ранее мы использовали эту строку вперед генетические экране мутагенеза ENU для идентификации микрофлорой мутантов склонны к T-все и учиться соматически приобретенных генетических событий, связанных с Т-клеток онкогенеза8,9.
Недавно Наша лаборатория расширена Утилита lck:eGFP рыбок данио. В двойной трансгенных rag2:hMYC (человеческий MYC), lck:eGFP D. рерио , которые известны для разработки T-все 10, мы обнаружили, что B-линии все также происходят11. В отличие от T-все в этой модели, которая ярко флуоресцировать благодаря высокая экспрессия гена GFP, B-все тускло люминесцентные из-за низких уровней GFP, позволяя рыбы с B-все следует отличать грубо от тех, с T-все с флуоресцентной микроскопии. Этот дифференцированный экспрессия гена GFP также позволяет разделение клетки GFPЛо B-все от GFPПривет T-все клетки с помощью СУИМ11. Кроме того низкий lck выражение не является уникальным для данио рерио B-все, как человека B-все также Ускоренная низкий уровень LCK11,12. Аналогичным образом, нормальные клетки B-линии D. рерио, мышей и людей также выразить низкий уровень lck/Lck/LCK, с незрелые клетки с высоким выражение11,13. На основе клеток в клетки B-линия в lckeGFP данио рерио или производной линии Экспресс 1-10% столько GFP как Т-лимфоцитов. Эти GFPЛо клетки Экспресс характеристикой клетки B мРНК, например pax5, cd79b, blnk, БТК, ighm, ighzи другие и может быть очищен от костного мозга, тимуса, селезенки или периферической 11крови. Таким образом оба B – и T-линии клетки могут быть изолированы от lckeGFP данио рерио и в случае rag2hMYC, lckeGFP животных, B – и T-все клетки также11.
Здесь мы представляем наш протокол эффективно очищают СУИМ доброкачественные клетки B от lck:eGFP данио рерио и доброкачественные или злокачественные клетки B rag2hMYC; LCK:eGFP рыбы, с использованием различных источников тканей. Такие клетки можно также выразить количественно подачей cytometry без изоляции СУИМ, при желании. Обнаружение низких lck выражения- и следовательно, низкая экспрессия гена GFP-от B клеток открывает новые возможности экспериментальных возможностей для lckeGFP данио рерио, такие, как в естественных условиях B ячейки развития исследований. Таким образом это трансгенные линии, впервые сообщалось в 2004 году, имеет новую жизнь, как мы стремимся использовать его для сбора свежих идей, касающихся данио рерио адаптивного иммунитета.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали и предоставляют протокол изолировать B клеток от lck:eGFP трансгенных данио рерио, добавляя это для других моделей D. рерио с B-линии этикетки3,4. Немного удивительно идентификации GFPЛо B клеток в этой линии незамеченным с ее описа?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Меган Мэлоун-Переса для ухода данио рерио и ядро цитометрии потока OUHSC. Эта работа была поддержана от грантов от Hyundai надежды на колесах, Оклахома центр по развитию науки и технике (HRP-067), награду пилотного проекта NIH/NIGMS INBRE (P20 GM103447). JKF проводит е.л. и Председатель наделен Тельма Gaylord в детской гематологии-онкологии детской больницы Фонд.
Materials
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 ml Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 ml conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin -Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1X | Life Technologies | 11835-030 |
Referenzen
- Paik, E. J., Zon, L. I. Hematopoietic development in the zebrafish. International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).
- Kasheta, M., et al. Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).
- Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).
- Schorpp, M., et al. Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish. Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
- Frazer, J. K., et al. Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen. Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Gutierrez, A., et al. Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia. Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).
- Borga, C., et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. , (2018).
- Haferlach, T., et al. Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group. Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).
- Novershtern, N., et al. Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis. Cell. 144 (2), 296-309 (2011).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
- Tang, Q., et al. Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).
