Данио рерио трансгенных lck:eGFP Экспресс GFP высоко в Т-лимфоцитов и были использованы для изучения развития Т-клеток и острый лимфобластный лейкоз. Эта строка может использоваться для исследования B клеток, которые выражают lck на более низких уровнях. Этот протокол описывает очищение злокачественных и доброкачественных клеток B от lck:eGFP рыбок данио.
Данио рерио (Danio рерио) являются мощным модель для изучения развития лимфоцитов. Как и млекопитающие D. рерио обладают адаптивной иммунной системы, которая включает B и T лимфоциты. Исследования у рыбок данио лимфопоэза трудны, потому что антитела, признавая D. рерио клеток поверхностных маркеров, как правило, не доступны, осложняющих изоляции и характеристика лимфоцитов различных групп населения, включая B-линии клетки. Трансгенные линии с Флюорофор линии конкретного выражения часто используются для обхода этой проблемы. Линия трансгенных lck:eGFP был использован для изучения развития D. рерио Т-клеток и также использовались для разработки модели Т-клеток и острый лимфобластный лейкоз (T-ALL). Хотя рыбы lck:eGFP широко использовались для анализа T-линии, они не использовались для изучения B клеток. Недавно мы обнаружили, что многие данио рерио B клетки также выразить lck, хотя и на более низких уровнях. Следовательно клетки lck:eGFP B также выразить низкий уровень GFP. Основываясь на этот вывод, мы разработали протокол, чтобы очистить клетки B-линии от lck:eGFP данио рерио, который мы приводим здесь. Наш метод описывает, как использовать люминесцентные активации клеток сортировщик (FACS) очищает клетки от lck:eGFP рыбы или связанные линии, такие как двойной трансгенных rag2:hMYC; LCK:eGFP рыбы. В этих строках, B клеток, особенно незрелые клетки B, Экспресс GFP на низкой, но обнаружить уровнях, позволяя им следует отличать от Т-клеток, которые выражают GFP высоко. B клетки могут быть изолированы от костного мозга, тимуса, селезенки, крови или других тканей. Этот протокол обеспечивает новый метод для очистки д рерио B клетки, включение исследований было сосредоточено на такие темы, как развитие B-клеток и лимфоцитов злокачественных опухолей.
Данио рерио предлагают мощные атрибутов, таких как генетические manipulability, высокая плодовитость, Оптическая прозрачность и быстрое развитие которые облегчают изучение развития позвоночных, использованием генетических подходов. Эти преимущества, вместе с общей характеристики костистых и млекопитающих кроветворения, делают D. рерио идеально подходит для в-vivo анализ функции лимфопоэза и лимфоцитов, от их раннее появление в личинки всей взрослой жизни. Развития крови в zebrafish опирается на хорошо сохранившихся генетических процессов, которые являются общими с млекопитающих, и они распространяются на адаптивной иммунной системы. Кроме того молекулярные механизмы, регулирующие развитие лимфоидных удивительно консервируют между1данио рерио и млекопитающих.
За последние 2 десятилетия трансгенных D. рерио линии что ярлык конкретные крови линий и мутантных линий дефицит этих линий были созданы2,3,4,5. Один из них, трансгенные линии lck:eGFP , использует данио рерио лимфоцитов белки тирозин киназы (lck) промоутер водить GFP выражение6. Этот ген, который сильно выраженные T-линии прекурсоров и зрелых Т-лимфоцитов, позволяет в естественных условиях, отслеживание развития тимуса Т-клеток и ex vivo очистки T-линии клеток, СУИМ7. Ранее мы использовали эту строку вперед генетические экране мутагенеза ENU для идентификации микрофлорой мутантов склонны к T-все и учиться соматически приобретенных генетических событий, связанных с Т-клеток онкогенеза8,9.
Недавно Наша лаборатория расширена Утилита lck:eGFP рыбок данио. В двойной трансгенных rag2:hMYC (человеческий MYC), lck:eGFP D. рерио , которые известны для разработки T-все 10, мы обнаружили, что B-линии все также происходят11. В отличие от T-все в этой модели, которая ярко флуоресцировать благодаря высокая экспрессия гена GFP, B-все тускло люминесцентные из-за низких уровней GFP, позволяя рыбы с B-все следует отличать грубо от тех, с T-все с флуоресцентной микроскопии. Этот дифференцированный экспрессия гена GFP также позволяет разделение клетки GFPЛо B-все от GFPПривет T-все клетки с помощью СУИМ11. Кроме того низкий lck выражение не является уникальным для данио рерио B-все, как человека B-все также Ускоренная низкий уровень LCK11,12. Аналогичным образом, нормальные клетки B-линии D. рерио, мышей и людей также выразить низкий уровень lck/Lck/LCK, с незрелые клетки с высоким выражение11,13. На основе клеток в клетки B-линия в lckeGFP данио рерио или производной линии Экспресс 1-10% столько GFP как Т-лимфоцитов. Эти GFPЛо клетки Экспресс характеристикой клетки B мРНК, например pax5, cd79b, blnk, БТК, ighm, ighzи другие и может быть очищен от костного мозга, тимуса, селезенки или периферической 11крови. Таким образом оба B – и T-линии клетки могут быть изолированы от lckeGFP данио рерио и в случае rag2hMYC, lckeGFP животных, B – и T-все клетки также11.
Здесь мы представляем наш протокол эффективно очищают СУИМ доброкачественные клетки B от lck:eGFP данио рерио и доброкачественные или злокачественные клетки B rag2hMYC; LCK:eGFP рыбы, с использованием различных источников тканей. Такие клетки можно также выразить количественно подачей cytometry без изоляции СУИМ, при желании. Обнаружение низких lck выражения- и следовательно, низкая экспрессия гена GFP-от B клеток открывает новые возможности экспериментальных возможностей для lckeGFP данио рерио, такие, как в естественных условиях B ячейки развития исследований. Таким образом это трансгенные линии, впервые сообщалось в 2004 году, имеет новую жизнь, как мы стремимся использовать его для сбора свежих идей, касающихся данио рерио адаптивного иммунитета.
Мы разработали и предоставляют протокол изолировать B клеток от lck:eGFP трансгенных данио рерио, добавляя это для других моделей D. рерио с B-линии этикетки3,4. Немного удивительно идентификации GFPЛо B клеток в этой линии незамеченным с ее описа?…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Меган Мэлоун-Переса для ухода данио рерио и ядро цитометрии потока OUHSC. Эта работа была поддержана от грантов от Hyundai надежды на колесах, Оклахома центр по развитию науки и технике (HRP-067), награду пилотного проекта NIH/NIGMS INBRE (P20 GM103447). JKF проводит е.л. и Председатель наделен Тельма Gaylord в детской гематологии-онкологии детской больницы Фонд.
35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
5 ml Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
50 ml conical tube | VWR international | 525-0448 | |
AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
Cytoflex | Beckman Coulter | ||
DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
FACSJazz | BD Biosciences | ||
Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
Penicilin -Streptomycin | Sigma | P4333 | |
Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
Plastic Transfer pippetes | |||
rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
RPMI Media 1640 1X | Life Technologies | 11835-030 |