בידוד Malignant ותאי B Non-Malignant מ lck:eGFP דג זברה
Summary
דג זברה מהונדס lck:eGFP אקספרס GFP מאוד לימפוציטים מסוג T, השתמשו ללמוד פיתוח תא T ו לוקמיה לימפובלסטית חריפה. הקו הזה יכול לשמש כדי מחקר B תאים, אשר אקספרס lck ברמות נמוכות. פרוטוקול זה מתאר טיהור תאי B ממאיר, שאינם ממאירים של דג זברה lck:eGFP .
Abstract
דג זברה (רזבורה rerio) הם במודל רב עוצמה ללמוד פיתוח לימפוציטים. כמו של יונקים, rerio ד בעלי מערכת חיסונית אדפטיבית הכוללת B ו- T לימפוציטים. מחקרים של דג זברה lymphopoiesis קשים בגלל נוגדנים זיהוי סמני פני שטח התא rerio ד הם בדרך כלל לא זמין, שמסבך בידוד ואפיון של אוכלוסיות שונות לימפוציט, כולל B-היוחסין תאים. קווים הטרנסגניים עם שושלת היוחסין הספציפי fluorophore ביטוי משמשים לעתים קרובות כדי לעקוף את האתגר הזה. הקו הטרנסגניים lck:eGFP שימש ללמוד פיתוח תא T rerio ד , יש גם מנוצל ועד פיתוח מודל T cell לוקמיה לימפובלסטית חריפה (T-ALL). למרות lck:eGFP דגים היה בשימוש נרחב כדי לנתח את T-שושלת היוחסין, הם לא שימשו ללמוד תאי B. לאחרונה גילינו כי הרבה תאים דג זברה B גם להביע lck, אם כי ברמות נמוכות. כתוצאה מכך, lck:eGFP B תאים לבטא גם רמות נמוכות של GFP. על סמך ממצא זה, פיתחנו פרוטוקול לטהר תאים B-השושלת lck:eGFP דג זברה, אשר אנחנו מדווחים כאן. השיטה שלנו מתאר כיצד לנצל את סדרן תא לפעיל על-פלורסנט (FACS) לטהר בתאי B lck:eGFP דגים או שורות קשורים, כגון כפול-הטרנסגניים rag2:hMYC; דגים lck:eGFP . בשורות אלו, בתאי B, במיוחד לא בוגר B תאים, אקספרס GFP ברמות נמוכות אבל לזיהוי, ולאפשר להם להיות מכובד מתאי T, המבטאות GFP מאוד. בתאי B יכול להיות מבודד מח, בלוטת התימוס, הטחול, דם או רקמות אחרות. פרוטוקול זה מספק שיטה חדשה לטהר את תאי B rerio ד , המאפשר לימודים ממוקד בנושאים כמו התפתחות תא B ו- B לימפוציטים גידולים ממאירים.
Introduction
דג זברה מציעים תכונות רב עוצמה, כגון manipulability גנטי, פוריות גבוהה, המוגבהת אופטי והתפתחות מהירה המאפשרים לימוד פיתוח חוליות שימוש בגישות גנטיות. יתרונות אלו, יחד עם התכונות המשותפות של hematopoiesis teleost, יונקים, להפוך rerio ד אידיאלי עבור ניתוחים ויוו של הפונקציה lymphopoiesis, לימפוציטים, מהמראה שלהם המוקדם בהזחלים לאורך הבגרות. פיתוח דם דג זברה מתבססת שנשמרת היטב תהליכים גנטיים משותפים עם יונקים, אלה להרחיב מערכת החיסון מסתגלת. בנוסף, מולקולרית מנגנונים המסדירים פיתוח הלימפה נשמרים להפליא בין דג זברה ויונקים1.
במהלך העשורים האחרונים 2, הטרנסגניים rerio ד קווים שושלות דם ספציפית את התווית, חסר מבחינות אלה שושלות מוטציה קווים נוצרו2,3,4,5. באחת מהן, הקו הטרנסגניים lck:eGFP , משתמשת דג זברה לימפוציט חלבון טירוזין קינאז (מזל) יזם לנהוג GFP ביטוי6. גן זה, אשר מתבטאת במיוחד על ידי T-השושלת מבשרי והן לימפוציטים T בוגרים, מאפשר ויוו מעקב אחר התפתחות הרתי תא T ו- ex-vivo טיהור תאי T-היוחסין מאת FACS7. בעבר, השתמשנו הקו הזה ב מסך מוטגנזה מכוונת ENU קדימה-גנטית כדי לזהות מוטציות germline נוטה T-כל וכדי ללמוד רכשה תחושתיים אירועים גנטיים הקשורים תא T-oncogenesis-8,–9.
לאחרונה, המעבדה שלנו עוד הרחיב את התועלת של דג זברה lck:eGFP . בכפול-הטרנסגניים rag2:hMYC (MYC אנושי), rerio lck:eGFP ד ידועים לפתח T-כל 10, גילינו B-השושלת כל להתרחש גם11. בניגוד T-כל במודל זה, אשר לזרוח בהירים עקב גבוה ביטוי GFP, B-כל הם במעומעם פלורסנט עקב רמות נמוכות GFP, ומאפשר דג עם B-כל להיות מכובד בגסות מאלה עם T-כל על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ביטוי זה-GFP דיפרנציאלית מאפשרת גם ההפרדה של GFPהלאו B-כל התאים של GFPהיי תאי T-כל שימוש FACS11. יתר על כן, ביטוי נמוך lck אינה ייחודית דג זברה B-כל, בתור האדם B-כל רמות גם צ’ק נמוך של LCK11,12. באופן דומה, תאים נורמליים B-היוחסין של rerio ד, בעכברים ובבני אדם לבטא גם רמות נמוכות של מזל/מזל/LCK, עם תאי B לא בשלה יש11,הביטוי הגבוהה ביותר13. על בסיס לכל תא, B-שושלת התאים בשורות דג זברה או נגזרות lckeGFP אקספרס 1-10% GFP באותה מידה כמו לימפוציטים מסוג T. האלה GFPהלאו תאים מאפיין אקספרס תא B mRNAs כגון pax5, cd79b, blnk, ה”לקשור, ighm, ighzואחרים, ואני יכול להיטהר מן מח, בלוטת התימוס, טחול או ציוד היקפי דם11. לכן, שני B – ו T-שושלת התאים יכולים להיות מבודדים מן lckeGFP דג זברה, ובמקרה של rag2hMYC, lckeGFP חיות, B – ו T-כל התאים גם11.
כאן, אנחנו מציגים פרוטוקול שלנו ביעילות לטהר FACS שאינם ממאירים בתאי B lck:eGFP דג זברה, ואת תאי B שאינם ממאירים או ממאיר של rag2hMYC; lck:eGFP דג, באמצעות רקמות מקור שונים. באופן דומה ניתן לכמת תאים כאלה על ידי cytometry זרימה ללא בידוד FACS, אם רצונך בכך. גילוי של ביטוי נמוך lck -כתוצאה מכך, נמוך ביטוי GFP-מאת B תאים פותח דלתות חדשות של אפשרויות ניסיוני lckeGFP דג זברה, כגון vivo ב B תא מחקרים התפתחותיים. לפיכך, הקו הזה מהונדס, דווח לראשונה בשנת 2004, יש חיים חדשים אנו שואפים לנצל את זה כדי ללקט תובנות טריים בדבר חסינות מסתגלת דג זברה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתח ואנו מספקים פרוטוקול כדי לבודד תאים B lck:eGFP דג זברה מהונדס, הוספת זה דגמים אחרים rerio ד עם B-השושלת תוויות3,4. באופן מפתיע למדי, הזיהוי של ה-GFPהלאו B תאים בשורה זו הלכה מעיניהם מאז התיאור שלו בשנת 2004. באופן כללי, lck נחשבת תא T ספציפי…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות מייגן מאלון-פרז לטיפול דג זברה, OUHSC הליבה cytometry זרימה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים יונדאי תקווה על גלגלים, אוקלהומה המרכז לקידום של המדע והטכנולוגיה (HRP-067), פרס הפרויקט טייס NIH/NIGMS INBRE (P20 GM103447). JKF מחזיק את תיאורטית יבשה & תלמה גיילורד הקתדרה של ילדים המטולוגיה-אונקולוגית לילדים החולים קרן.
Materials
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 ml Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 ml conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin -Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1X | Life Technologies | 11835-030 |
Referenzen
- Paik, E. J., Zon, L. I. Hematopoietic development in the zebrafish. International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).
- Kasheta, M., et al. Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).
- Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).
- Schorpp, M., et al. Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish. Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
- Frazer, J. K., et al. Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen. Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Gutierrez, A., et al. Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia. Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).
- Borga, C., et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. , (2018).
- Haferlach, T., et al. Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group. Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).
- Novershtern, N., et al. Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis. Cell. 144 (2), 296-309 (2011).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
- Tang, Q., et al. Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).
