Wir präsentieren ein optimiertes lokales Auswurfverfahren mit einer Glas-Mikropipette und einem schnellen Zwei-Photon-Hyperstack-Bildgebungsverfahren, das eine präzise Messung von Änderungen des Kapillardurchmessers und die Untersuchung seiner Regulierung in drei Dimensionen ermöglicht.
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Methodenartikel
In Vivo dreidimensionale zwei-photonische Mikroskopie zur Untersuchung von durchgeführten Gefäßreaktionen durch lokale ATP-Auswurf mit einer Glas-Mikropipette
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Aufrechterhaltung der normalen Gehirnfunktion erfordert eine ausreichende und effiziente Versorgung mit Sauerstoff und Ernährung durch ein komplexes Netzwerk von Gefäßen. Die Regulierung des zerebralen Blutflusses (CBF) ist jedoch unvollständig verstanden, insbesondere auf Kapillarebene. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das häufig zur Untersuchung von CBF und seiner Regulierung eingesetzt wird. Derzeit ist dieses Feld durch den Mangel an in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie-Studien begrenzt, die (1) CBF-Antworten in drei Dimensionen untersuchen, (2) vaskuläre Reaktionen und (3) lokalisierte Interventionen innerhalb des Gefäßnetzwerks durchführen. Hier beschreiben wir eine 3D-in-vivo-Methode, die die Zwei-Photonen-Mikroskopie verwendet, um durchgeführte Gefäßreaktionen zu untersuchen, die durch den lokalen Auswurf von ATP mit einer Glasmikropipette ausgelöst wurden. Unsere Methode verwendet schnelle und sich wiederholende Hyperstack-Zwei-Photon-Bildgebung, die präzise Durchmessermessungen durch maximale Intensitätsprojektion der erhaltenen Bilder ermöglicht. Darüber hinaus zeigen wir, dass diese Methode auch verwendet werden kann, um 3D-astrozytische Kalzium-Antworten zu untersuchen. Wir besprechen auch die Vorteile und Grenzen des Einsetzens von Mikropipetten aus Glas und der Zwei-Photonen-Hyperstack-Bildgebung.
Einleitung
Das Gehirn hat eine hohe Energieverbrauchsrate. Etwa 20% des Sauerstoffs und 25% der Glukose, die vom menschlichen Körper verbraucht wird, sind der Gehirnfunktion gewidmet, während das Gehirn nur 2% der gesamten Körpermasse einnimmt. Die Aufrechterhaltung der normalen Gehirnfunktion erfordert eine ausreichende und effiziente Versorgung mit Sauerstoff und Ernährung durch Dendurchfluss in einem komplexen Netzwerk von Gefäßen. Lokale Gehirnaktivität und zerebraler Blutfluss (CBF) sind robust gekoppelt, abhängig von den funktionellen Eigenschaften von Neuronen, Astrozyten, Pericyten, glatten Muskelzellen (SMCs) und Endothelzellen (ECs)1. Kürzlich h....
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Protokoll
Alle Verfahren, an denen Tiere beteiligt waren, wurden von der dänischen Nationalen Ethikkommission gemäß den Leitlinien des Übereinkommens des Europäischen Rates zum Schutz von Wirbeltieren, die für experimentelle und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, genehmigt. den ARRIVE-Richtlinien entsprachen. Dies ist ein terminales Verfahren, bei dem die Mäuse vor der Anästhesie-Wiederherstellung eingeschläfert werden.
1. Prächirurgische Präparation
- Reinigen Sie den OP-Tisch und die umgebung mit 70% Ethanol. Reinigen und trocknen Sie die chirurgischen Werkzeuge vor der Operation gründlich. ....
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Ergebnisse
Nach Abschluss der Operation wurden die Mäuse zum Zwei-Photonen-Mikroskop transportiert (Abbildung 1A). Eine Glas-Mikropipette mit 1 mM ATP wurde in der Nähe des Zielblutgefäßes am Zielort eingesetzt (Abbildung 1B).
Wir führten Hyperstack-Bildgebung durch, während wir einen Puff von 1 mM ATP gaben (Abbildung 2A, Ergänzendes Video 1). Jede.......
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Diskussion
Eine Herausforderung für Gefäßstudien ist die präzise Messung der Gefäßdurchmesser. Die Methode, die wir hier beschreiben, verwendete ein motorisiertes Piezoobjektiv, um eine schnelle und sich wiederholende Hyperstack-Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie zu machen. Erstens ermöglicht diese Methode wiederholte Untersuchungen der durchdringenden Arteriole,1. Ordnung und 2. Ordnung Kapillaren ohne Fokusverlust und führte zur Entdeckung von langsam durchgeführten Gefäßreaktionen in Kapillaren in vivo........
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Studie wurde von der Lundbeck-Stiftung, der NOVO-Nordisk Foundation, dem Dänischen Rat für unabhängige Forschung | Medical Sciences und die NORDEA Foundation Grant an das Center for Healthy Aging.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Agarose | Sigma– Aldrich | A6138 | Zum Schutz auf den freiliegenden Kortex auftragen |
| Alexa 594 | Life Technologies | A-10438 | Fleckenblähmasse auf rot fluoreszierendes |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | Vasodilatator und Vasokonstriktor, Puffmasse |
| Cyanacrylatkleber und Aktivator | Loctite-Klebstoffe | und SF7452 | Kleber für Metallstück und Deckglas |
| Auge Gleitmittel | Neutral Ophtha, Ophtha A/S, Dänemark | Halten Sie die Augen der Maus mit Feuchtigkeit | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD500S | Blutserumfarbstoff, grün fluoreszierende Farbe |
| NG2DsRote Mäuse | Jackson Laboratory | 8241 | Diese transgenen Mäuse exprimieren eine rot fluoreszierende Proteinvariante (DsRed) unter der Kontrolle des Maus-NG2 (Cspg4)-Promotors |
| pZac2.1 gfaABC1D-lck-GCaMP6f | Addgene | 52924-AAV5 | Astrozytenspezifische virale Vektoren, die genetisch kodierte Calciumindikatoren tragen |
| TRITC-Dextran | Sigma-Aldrich | 52194 | Blutserumfarbstoff, rot fluoreszierende Farbe |
| Liste der Ausrüstungen | |||
| Luftpumpe | WPI | PV830 | Geben Sie Luftdruck zum Pipettenaufblasen |
| Blutgasanalysator | Radiometer | ABL 700 | Messung des Niveaus von Blutgasen |
| Blutdruckmessgerät | World Precision Instruments | BP-1 | Messgerät des ateriellen Blutdrucks |
| Körpertemperaturregler | CWE | Modell TC-1000 | Halten Sie die Körpertemperatur der Maus im physiologischen Bereich |
| Kapnograph | Harvard Gerät | Typ 340 | Überwachen Sie das endexspiratorische CO2 von der Maus |
| Elektrischer Stimulator | A.M.P.I. | ISO-flex | Apply Whisker Pad Stimulation |
| Mechanisches Beatmungsgerät | Harvard Gerät | D-79232 | Mechanisches Beatmung der Maus im physiologischen Bereich |
| Mikropipettenzieher | Sutter Instrument | P-97 | |
| Zwei-Photonen-Mikroskop | Femtonics Ltd | Femto3D-RC | |
| strong>Liste der chirurgischen Instrumente | |||
| Anatomische Pinzette | Lawton | 09-0007 | |
| Abgewinkelte und ausbalancierte Pinzette | S& T AG | 00595 FRAS-18 RM-8 | |
| Irisschere | Lawton | 05-1450 | |
| Mikro-Gefäßklemme | S& T AG | 462 | |
| Gefäßkatheter für Mäuse | Verutech | 100828 |
Referenzen
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and Function of the Blood-Brain Barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Hall, C. N., et al. Capillary Pericytes Regulate Cerebral Blood Flow in Health and Disease. Nature
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Nachdrucke und Genehmigungen
